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小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)的培养要点及高效转染试剂
发布时间:2020-06-15   点击次数:173次

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)是通过Abelson鼠白血病病毒诱导BALB/c小鼠产生肿瘤后得到的细胞株。其在医学研究中应用十分普遍,是许多白血病相关研究模型的常用细胞株,在微生物学、免疫学等研究中也十分常用。但RAW264.7细胞形态和分化状态多变,在实际培养中较难把握,给科研工作带来了一定困难;且RAW264.7细胞很难转染,许多研究者表示Lipofectamine 2000根本转不进去,或者仅有不到10%的转染效率。因此RAW264.7细胞的培养及转染方法就很值得去探讨,本文就这些方面进行介绍,以供科研工作者借鉴。

一、RAW264.7细胞的形态特征

很多人养RAW264.7细胞时发现自己的细胞出现伪足;就连ATCC的描述也称RAW264.7细胞形态多样,可有圆形、类圆形,以及长出伪足的长梭形、多边形,可单核可多核。而实际,有伪足的情况是RAW264.7细胞受到外界刺激进行了分化,是细胞衰老、分化的表现;RAW264.7细胞的较佳形态应是较小的单核圆形细胞

二、RAW264.7细胞的培养条件

RAW264.7细胞的培养环境与一般贴壁细胞并无差异。即培养箱温度为37℃CO2浓度为5%ATCC推荐的培养基为DMEM+10%的胎牛血清;实际上,经研究者们实验发现高糖型DMEM培养的RAW264.7细胞传代后贴壁更快、细胞生长速度更快。因此,推荐使用高糖型DMEMFBS浓度为10%,作为RAW264.7细胞的培养基。

三、RAW264.7细胞的传代

关于RAW264.7细胞的传代方法,ATCC推荐使用细胞刮刀。也可采用0.25%的胰酶消化或采用弯嘴吸管吹打等方法。采用细胞刮刀进行传代时,细胞能较大限度被收集起来,但会对细胞造成机械性损伤、影响细胞形态及贴壁时间等。采用胰酶消化时,由于RAW264.7细胞贴壁较牢,消化时间就较长。但消化时间点不易把握,易消化过度,对细胞生长造成抑制。

因此,推荐使用弯嘴吸管吹打进行传代。具体做法是,当细胞达到传代密度时,先弃去培养基,用预冷的PBS洗涤两次,用弯嘴吸管吸取培养基,均匀、稍用力吹打瓶底,即可将细胞吹打下来(吹不下来的就不要了),离心后重悬即可分瓶培养。2 h后可见细胞贴壁。

由于RAW264.7细胞生长速度较快,一般1-2d换液1次,密度长至60%-70%左右即可传代,传代比例可为1:3-1:6。若传代间隔太久,细胞生长密度过大,细胞也容易发生分化,出现长伪足的多形细胞。

四、RAW264.7细胞的冻存及复苏

RAW264.7细胞的冻存及复苏方法与一般贴壁细胞并无较大差别。但由于RAW264.7细胞对外界刺激较敏感,对营养条件要求较高,许多人建议降低DMSO的浓度,增加FBS血清的浓度。因此冻存液的推荐配方为5% DMSO20% FBS的培养基(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞的培养及其在诱导破骨细胞中的应用,许丹等,中国骨质疏松杂志,2016, 10, 22, 10)。

五、RAW264.7细胞的转染

(一)以往转染数据

RAW264.7细胞是一种巨噬细胞,有很强的贴壁性和伪足产生性,其转染较难,一般采用电转或慢病毒稳转的方法。有研究者对RAW264.7细胞用几种不同的转染方法进行处理,对转染效率进行比较。结果发现,脂质体转染(Lipofectamine 2000, Invitrogen)效率较低,仅为12.17±1.53%,慢病毒转染效率较高,可达34.75 ± 5.30%,罗氏转染(X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent, Roche)和电穿孔转染效率分别为16.52 ± 3.86%15.73 ± 3.29%(巨噬细胞RAW264.7不同转染方法的比较,李亚等,生物技术,2014, 24, 2)。

(二)高效转染试剂

既然RAW264.7细胞这么难转染,实验还得继续,那怎么办呢?

不要担心,现在ZETA LIFE新推出一款Advanced系列高效DNARNA转染试剂。其广泛适用于贴壁细胞和悬浮细胞的转染,可转DNARNA,也可共转染,还可进行小动物活体转染。

这一款转染试剂有以下几个特点:

1.适用细胞广

 广泛用于293T9LA172, A375, A549, COS7, CHO-K1, C6S, C2C12, NIH3T3, RG2, T98G, U87, U118, MDCK, MCF-7, HT1080, HEK, H4, RAW264.7等多种细胞系。

2.细胞毒性低

其细胞存活率可高达98%,平均细胞存活率可达80%

3.转染效率高

其转染效率可高达96%,平均转染效率可达70%

三)Advanced系列高效DNARNA转染试剂转染质粒进RAW264.7的实例(来自实验者的实际数据)

由上图可明显看出Advanced系列高效DNARNA转染试剂对RAW264.7转质粒的转染效率高达95%以上,且细胞存活率较高。

相信Advanced系列高效DNARNA转染试剂 将是您对的选择,希望能为您的研究助力。

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