一、 实验目的

1、了解透射电子显微镜的结构和工作原理。

2、了解透射电子显微镜样品制备的方法。

二、实验原理.

透射电子显微镜是以波长极短的电子束作为照明源，用电磁透镜聚焦成像的一种高分辨

本领、高放大倍数的电子光学显微镜。透射电镜的总体工作原理是:由电子枪发射出来的电

子束，在真空通道中沿着镜体光轴穿越聚光镜，通过聚光镜将之会聚成一束尖细、明亮而又

均匀的光斑，照射在样品室内的样品上;透过样品后的电子束携带有样品内部的结构信息，

样品内致密处透过的电子量少,稀疏处透过的电子量多;经过物镜的会聚调焦和初级放大后，

电子束进入下级的中间透镜和第1、第2投影镜进行综合放大成像，被放大了的电子影

像投射在观察室内的荧光屏板上;荧光屏将电子影像转化为可见光影像以供使用者观察。

三、透射电镜的结构

透射电子显微镜由三大部分组成: 1、电子光学系统(镜体):照明源(电子枪聚光镜)、

成像系统(样品镜、物镜、中间镜、投影镜)、观察记录系统。2、真空系统。3、电源与控

制系统

四、超薄切片制备技术步骤

透射电镜的成像是由一定强度的电子束透过标本而成像。由于电子射线的穿透能力比较低，电镜又具有很高的分辨率和放大率，因此, 电镜标本需要厚度在0.03～0.05μm的超薄切片，以获得高分辨的超微结构图像。

超薄切片制作过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节。

（一）取材

取材是超薄切片技术的关键环节。由于生物组织离体后，细胞将会立即释放出各种水解酶引起细胞自溶，使细饱内部微细结构发生变化。因此，为尽可能避免产生人工假像，取材时有以下要求：

1． 取材要快，一般要求在1min内把组织块浸入固定液。

2． 组织块要小，一般切成0.5～1.0mm。

3． 所用固定液及容器须预冷，以降低离体细胞内水解酶的活性，尽可能减少细胞自溶。

4． 由于电镜观察视野小，具有很大的局限性，所以，选择部位要准确可靠。

5． 切割组织的刀、剪必须锋利干净，避免拉、锯、压等动作造成细胞损伤。

（二）固定

1. 固定的作用 标本固定在于：

①破坏细胞的酶系统，阻止细胞的自溶；

②稳定细胞物质成分，如核酸、核蛋白，糖类和脂类，使之发生交联，减少或避免抽提作用，以保存组织成分；

③在一些细胞组分之间以化学反应和物理反应建立交联，以提供骨架来稳定各种细胞器的空间构型；

④能提供一定的电子反差。

2. 常用的固定剂　理想的固定剂须具备的条件有：

①能迅速渗入组织细胞内，尽快固定细胞以减少组织自溶；

②能稳定细胞各种结构成分，使其在脱水、渗透及包埋等过程中不溶解和丢失；

③避免细胞结构膨胀或收缩，以保证获得真实结构的电镜图像；

④能保存酶的活性以供电镜细胞化学研究。目前尚未找到一种能满足上述全部功能的理想固定剂，较理想和常用的固定剂有四氧~化锇、醛类、高锰酸钾等。

3. 固定方法　目前，用于生物样品超薄切片技术的主要固定方法是化学固定法。采用戊二醛 (或戊二醛+多聚甲醛)固定l～3h后，经相应的缓冲液冲洗，再用1%锇酸后固定1～2h。

生物样品有多种多样，对于不同的材料和组织部位，其固定方式是不同的。

（1）浸泡固定：适用于一些能允许在短时间内停止供血而仍保持其功能和结构的器官或组织，以及一些病理检查的样品。其方法是经解剖 (或手术)尽快从机体中取出所需组织，并按取材要求，把组织切成小块，放入小瓶子内作常规双重固定。

（2）血管灌注固定：适用于取材较复杂或对缺氧较敏感的器官或组织，须采用血管灌注固定。可根据动物的大小选用全身灌注或局部灌注的方式。

（3）培养细胞的固定：如所固定材料为微生物、单细胞原生动物、细胞提取物或组织培养的细胞，则应先离心倒去上面的培养液 (或上清液)，然后才按常规方法进行双重固定。戊二醛固定时间为15～30min，锇酸固定时间为15～40min。

对于试管或培养瓶培养的单层细胞，在倾去培养液后，即加入前固定液，并轻刮下细胞，用2000r/min离心15～20min，使细胞成团。然后倾去上清液，再缓慢加入新鲜的前固定液，以免将细胞团冲散，并继续进行双重固定。

4. 固定时注意事项

（1）固定液的浓度：固定液浓度要适宜。一般戊二醛常用浓度为1％～4％,锇酸为1％～2％。

（2）固定液的渗透压：固定液的渗透压须调节到接近组织、细胞的生理值。固定液的渗透压是通过改变缓冲液的浓度或者通过增加钠、钙和镁等电解质或葡萄糖和蔗糖等非电解质来调节的。

（3）固定液的pH值：固定液pH值须接近所要固定组织的pH值。由于大部分动物组织的平均pH值约7.4, 因此，电镜固定液的pH值都选用中性 (7.2～7.4)。

（4）固定时的温度 理论上，低温能降低酶的活性，减少细胞自溶和胞内物质的抽提，因此，大部分样品宜在0℃～4℃下固定。

（三）脱水

脱水是指用适当的有机溶剂取代组织细胞中的游离水，因水分的存在会使组织结构在电镜高真空状态下急剧收缩而遭破坏，另外包埋剂是非水溶性的，细胞中的游离水会影响包埋剂的浸透，因此，脱水是一个很重要的步骤。

（四）渗透与包埋

渗透和包埋的目的是取代活组织中的水分以及支持整个结构，以便标本有特定的机械性利于切片。

1. 常用包埋剂及配方　包埋剂种类颇多，目前普遍使用的是环氧树脂。为改善包埋块的切割性能，有时在环氧树脂包埋剂配方中再加一些增塑剂，以调节包埋块的韧性。

环氧树脂包埋剂对细胞微细结构有较好的保存性能，聚合后体积收缩率较小，为2％～5％，而且在真空中能经受较长时间的轰击。但它操作不大方便，反差较弱。

环氧树脂的型号较多，常用Epon812、Spur树脂(ERL-4206) 、TAAB812，还有国产的环氧树脂618和600等。

2. 渗透与包埋步骤　样品在*脱水后，即可进入渗透。将样品置于100％脱水剂及等量包埋剂的混合液中(室温下30min或数h)；第二步是将样品置于纯包埋剂中(室温6h或过夜),然后可行包埋: 将渗透后的样品挑入已装有包埋剂的多孔橡胶模板中，将包埋剂灌满，放入标签，然后根据包埋剂聚合时所需的温度及时间聚合，制成包埋块。

（五）超薄切片

超薄切片的面积为0.5mm×0.5mm左右，要切出较理想的超薄切片，不仅超薄切片机质量好，还要有渗透、包埋好的包埋块，以及要有好的切片刀和操作者技术熟练等。其步骤是：

1. 定位、修块　定位、修块是指保留要进行电镜观察部分，把其余部分削去，以利进行超薄切片。

2. 制刀　用于超薄切片有钻石刀和玻璃刀。玻璃刀因价格低廉而被常用。

玻璃刀经检查后的刀还须在刀上作一小水槽，以便在切片时让切下来的超薄切片漂浮在液面上。为防止漏水，边沿须用石蜡或指甲油焊封。在焊接时，应注意刀刃不要粘上石蜡或其他的焊封剂，以免损伤刀刃。

3. 载网和支持膜制备　超薄切片须置于一种载网上才能进行观察。载网一般采用很薄的铜片，此外，还有镍网、银、钼、不锈钢、尼龙等材料制成的载网。

（六）超薄切片机

超薄切片机有热膨胀式和机械进刀式两类，后者较常用，它是以微动螺旋和微动杠杆来提供微小进刀而切出切片，如Leica超薄切片机。

（七）切片染色

（1）染色的作用：所谓电子染色是利用某些金属盐(如铅、铀、锇等)能与细胞的某些结构和成分结合，以增加其电子散射能力，进而达到提高反差的一种方法，不同结构成分上吸附有不同数量重金属原子，结合重金属原子较多的区域(即结构致密、原子序数高的部分)具有较强的电子散射能力，在电镜下呈现为电子致密的黑色；结合重金属原子较少的区域则为浅黑色，灰黑色，没有结合重金属的区域是电子透明的区域，因此，经过电子染色处理可提高样品反差，增加图像清晰度。