免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）

一、实验原理

以（抗体和抗原）之间的专一性作用为基础的用于研究（蛋白质相互作用）的经典方法。是确定两种蛋白质在完整（细胞内生理性）相互作用的有效方法。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

CO-IP应用与IP区别

1、测定两种目标蛋白质是否在体内结合

2、确定一种特定蛋白质的新的作用搭档

CO-IP与IP只取决于检测焦点是初级靶分子（抗原）还是次级靶分子（相互作用蛋白）

二、实验过程

1、提取蛋白。

2、在细胞裂解液中加入抗X的抗体。

3、孵育后再加入Protein A或G(于Agarose 或magnetic beads等介质上)。

若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成复合物：“Y—X—抗X抗体—Protein A或G"

4、经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。（xy抗原、x抗体）。

5、western blot分析，质谱分析。

（Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。）

ProteinA/G的作用及原理

“捕获”抗体，形成复合物，

抗体-目的蛋白-ProteinA/G beads 非共价健结合

ProteinA/G- beads 共价结合

三、CO-IP特征

优点：

1、相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态。

2、蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响。

3、可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

局限性：

1、可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用

2、两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三者在中间起桥梁作用；

3、必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果

四、实验的关键

1、实验需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。

2、为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。

3、考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。

4、确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。

五、注意的问题：

1、裂解液

(1)、细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。

(2)、不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktail

2、免疫沉淀中抗体的选择

3、抗体

使用对照抗体：（阴性和阳性）

阴性：单克隆抗体：同一种属的IgG

兔多克隆抗体：正常兔IgG

阳性：细胞内某种蛋白的抗体（做膜蛋白A，用膜蛋白B）

六、未检测到目得蛋白或蛋白很少

可能原因

1、样品被蛋白酶降解：

添加蛋白酶抑制剂；所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融

2、抗体浓度太低：

调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索较佳浓度

3、抗抗体亲合力太低：

选用适合于IP和/或IB的相应抗体

4、IP抗体未与珠子结合：

选用适合于IP的相应珠子，正确保存防止变质或干燥

5、Tag未暴露在融合蛋白构象的表面：

改变tag融合表达部位

6、裂解液严谨度太高：

改用低严谨度裂解液

七、目得蛋白高背景

可能原因

1、非特异蛋白结合：

（1）在无血清培养液中裂解细胞；

（2）在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子预洗，

（3）免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂）

2、裂解液严谨度太低：

改用高严谨度裂解液。

3、实验仪器或液体被污染：

使用洁净的仪器或液体。

4、转移膜上的非特异吸附：

戴手套，用镊子夹取，不要接触膜转移面。