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创凌生物浅析免疫共沉淀Co-IP
发布时间:2020-09-16   点击次数:75次

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)

一、实验原理

以(抗体和抗原)之间的专一性作用为基础的用于研究(蛋白质相互作用)的经典方法。是确定两种蛋白质在完整(细胞内生理性)相互作用的有效方法。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

 

CO-IP应用与IP区别

1、测定两种目标蛋白质是否在体内结合

2、确定一种特定蛋白质的新的作用搭档

CO-IP与IP只取决于检测焦点是初级靶分子(抗原)还是次级靶分子(相互作用蛋白)

 

二、实验过程

1、提取蛋白。

2、在细胞裂解液中加入抗X的抗体。

3、孵育后再加入Protein A或G(于Agarose 或magnetic beads等介质上)。

若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白,就可以形成复合物:“Y—X—抗X抗体—Protein A或G"

4、经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳,复合物又被分开。(xy抗原、x抗体)。

5、western blot分析,质谱分析。

(Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质,能特异性地与人和哺乳动物抗体(主要是IgG)的Fc区结合。)

ProteinA/G的作用及原理

“捕获”抗体,形成复合物,

抗体-目的蛋白-ProteinA/G beads 非共价健结合

ProteinA/G- beads 共价结合

 

三、CO-IP特征

优点:

1、相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态。

2、蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响。

3、可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

 

局限性:

1、可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用

2、两种蛋白质的结合可能不是直接结合,有第三者在中间起桥梁作用;

3、必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,若预测不正确,实验就得不到结果

四、实验的关键

1、实验最需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。

2、为防止蛋白的分解、修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂,低温下进行实验。

3、考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。

4、确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

五、注意的问题:

1、裂解液

(1)、细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。

(2)、不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的cocktail

2、免疫沉淀中抗体的选择

3、抗体

使用对照抗体:(阴性和阳性)

阴性:单克隆抗体:同一种属的IgG

兔多克隆抗体:正常兔IgG

阳性:细胞内某种蛋白的抗体(做膜蛋白A,用膜蛋白B)

 

六、未检测到目得蛋白或蛋白很少

可能原因

1、样品被蛋白酶降解:

添加蛋白酶抑制剂;所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融

2、抗体浓度太低:

调整抗体浓度,必要时设立浓度梯度,摸索佳浓度

3、抗抗体亲合力太低:

选用适合于IP和/或IB的相应抗体

4、IP抗体未与珠子结合:

选用适合于IP的相应珠子,正确保存防止变质或干燥

5、Tag未暴露在融合蛋白构象的表面:

改变tag融合表达部位

6、裂解液严谨度太高:

改用低严谨度裂解液

 

七、目得蛋白高背景

可能原因

1、非特异蛋白结合:

(1)在无血清培养液中裂解细胞;

(2)在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子预洗,

(3)免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度(高盐或去垢剂)

2、裂解液严谨度太低:

改用高严谨度裂解液。

3、实验仪器或液体被污染:

使用洁净的仪器或液体。

4、转移膜上的非特异吸附:

戴手套,用镊子夹取,不要接触膜转移面。

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