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细胞划痕实验原理及步骤及注意事项
发布时间:2020-09-18   点击次数:189次

细胞划痕实验原理

细胞划痕实验(Wound Healing)是一种操作简单,经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。这种方法的原理是,当细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域,称为“划痕”,划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合,在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程,是研究细胞迁移的体外实验中简单的方法。细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法,实验成本低,可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。


实验材料:细胞样品
仪器、耗材:6孔板 marker笔 直尺 *头 20微升枪头(灭菌)
试剂、试剂盒:无血清培养基、PBS

实验步骤:
一.准备:
所有能灭菌的器械都要灭菌,直尺和marker笔在操作前紫外照射30min(超净台内)
二.流程:
(1)准备工作:所有能灭菌的器械都要灭菌,直尺和marker笔在操作前紫外照射30min(超净台内)

(2)先用marker笔在6孔板背后,用直尺比着,均匀地划横线,大约每隔0.5~1cm一道,横穿过孔。每孔至少穿过5条线。

(3)在空中加入约5X105个细胞,具体数量因细胞不同而不同,掌握为过夜能铺满。

(4)第二天用枪头比着直尺,尽量垂直于背后的横线划痕,枪头要垂直,不要倾斜。

(5)用PBS洗细胞3次,去除划下的细胞,加入无血清培养基。

(6)放入37℃5%CO2培养箱培养。按0、6、12、24小时取样,拍照。

 

注意的几个问题:

1、划痕前是不倒培养基的,划痕后再倒掉培养基加PBS清洗后加吴学谦培养基;
细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域,称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。因此是整个培养皿都加培养基的,观察部位是划痕而已。
2、通过算每个视野的划痕面积,可以通过image J 软件计算。
3、划痕法的意义在于,价格低廉,操作简单。还有很重要的一点在于细胞外围环境简单单纯,容易控制。(比如做加药的,可能会和血清的组分有反映,而且受血清批次的影响,造成误差。如果是铺了ECM物质的,组分就更复杂了。)
.划痕法测量适用的细胞范围较小,一般只适用于上皮细胞,纤维样细胞。因为
a.这些细胞本身有迁移能力,且较强。
b.细胞有极性,方便测量,观察。
c.细胞对无血清有较强的忍受力(至少24小时),因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的,很多肿瘤细胞系在无血清培养下,12小时细胞凋亡就超过50%。这也就是transwell发展的最大要求。而一些上皮样细胞系甚至可以忍受高达72小时的无血清实验。足以弥合划痕。
4、其实在伤口弥合中,fibroblast的向创口处迁移就是典型的侧向爬行。但是其实癌细胞的迁移倒不是侧向爬行那么简单,我觉得应该是综合效应,而且要看是什么类型的肿瘤。因为对于远端病灶的转移,显然是通过血液运输的。这是一个细胞去黏附和再黏附的过程。其实transwell也不能很好的模仿这个过程。只是transwell+matrigel可以模仿肿瘤细胞融解基质,侵入到正常组织的这个过程。也就是侵袭。所以对于做cancer的来说,可能transwell会更好些。但我觉得并不能就简单否定scar assay。细胞的迁移作为细胞的一个正常生理活动,是表征细胞生理变化的一个重要指标。这点是很主要的意义。

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