一、细胞培养及转染

一、实验方法

1. 培养293T细胞，待细胞长满后调整细胞浓度为1×105cells/ml，接种于24孔培养板，每孔500uL，37℃，5%CO2培养箱内培养24h，观察细胞80%粘连。

 2. 制备转染复合物

A) 用100μl无血清培养基稀释3’UTR双荧光素酶报告基因载体，轻轻混匀；

B) 用100μl无血清培养基稀释RBP过表达载体，轻轻混匀；

C) Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用100μl无血清培养基稀释2.5μl Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5min；

D) 将A、 B、C的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20min，转染复合物形成。

3. 将24孔板中200μl 培养基，再分别加入300uL上述混合液，每孔终体积为500uL。质粒浓度均为500ng/孔，每组设置3个复孔。

5. 37 ℃，5%CO2培养箱内培养4-6h后，吸掉上清液，加入500uL的*培养基，于培养箱内培养48h后备用。

二、双荧光报告基因检测

2.1 实验材料

 双荧光检测试剂盒(promega E1910)

脱色摇床(海门市其林贝尔TS200A)，低温冷冻离心机 (Sigma 3K15)，发光检测仪 (Molecular Devices SpectraMax®i3 )。

2.2 实验方法

具体实验步骤参见试剂盒说明书

裂解细胞 ：吸尽细胞培养液后， PBS轻柔漂洗两次，参考下表加入适量的1×PLB裂解液(用去离子水将5×Passive Lysis Buffer母液稀释成1×PLB，可在4℃保存1个月)，室温摇床放置15min充分裂解后备用。

注：细胞裂解后可以立即测定，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需融解，并达到室温后再进行测定。

水浴溶解Luciferase Assay Buffer Ⅱ溶液后，加入到1剂量的Luciferase Assay Substrate冻干粉中，充分溶解后分装成若干小管，储存在-20℃(≦1个月)或-70℃(≦1年)，使用前水浴解冻，上下颠倒两次并恢复至室温备用

按照每个样本100uL用量，取适量50×Stop & Glo®Reagent，用Stop & Glo®Buffer稀释成1×Stop & Glo®Reagent，现配现用。

按仪器操作说明书开启化学发光仪或具有检测化学发光功能的多功能酶标仪，将测定间隔设为2秒，测定时间设为10秒。

每个样品测定时，取样品20uL，加入100uL LARⅡ试剂，用枪打匀后测定RLU1(relative light unit)。

加入100uL1×Stop & Glo®Reagent，用枪打匀后测定RLU2(relative light unit)。

2.3实验结果分析