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美国Biozellen3D细胞培养基质胶的制备
发布时间:2021-12-16   点击次数:203次

使用步骤:

A、试剂制备

A基质胶:将A基质胶溶于37℃水浴槽回温10分钟, 确认完全融解.

C缓冲溶液(1X)制备:使用前将10X C缓冲溶液用冰的无细胞培养液(例如: 无血清DMEM、opt-MEM) 制备成 1X C 缓冲溶液。(不要用 PBS 稀释 C 缓冲液) .

D 缓冲溶液(1X)制备: 使用前用冷的 1x PBS 稀释 10X D 缓冲溶液至 1X D 缓冲溶液.

B、Biozellen®3D细胞培养基质胶的制备

全部步骤需要在无菌环境内操作,操作步骤如下:

1. 将24孔培养板放置于冰上预冷半小时。

2. 细胞计数后取 2×105~2×107 细胞与 0.5 毫升 37℃ 细胞培养基均匀混合,并与0.5毫升37℃ A胶按照 1:1 等比例均匀混合,最终细胞密度1*105~1*107cells/mL。

:请选择适当的培养溶液与条件进行试验。

3.取 20-40 微升步骤 2的混合液滴于 步骤 1 预冷的培养板上,胶体将于 5 分钟内成胶。 注: 测试胶体是否成胶,可用微量吸管尖温和的触碰胶体表面进行确认。

4.待胶体成胶后,添加1毫升冰的1X C缓冲溶液,并盖过步骤3 的胶溶液,固定 15 分钟。

5.待15分钟固定后,小心的吸取 C 缓冲溶液并置换为适合此细胞生长之培养基溶液。

6将含有细胞的胶于37°C 二氧化碳培养箱内进行7~14天的培养,并观察细胞球体的形成,按正常培养基更换频率进行更换操作。

C、溶胶与收集细胞球体准备程序

小心的将培养基吸取移除,并用1X PBS进行清洗。

小心的将 1X PBS 吸取移除,并添加 1 毫升冰的D缓冲溶液,盖过胶滴于室温反应 5分钟。

温和的用1毫升移液管吸取,直到胶滴完全溶解。

将含有细胞球体的溶液吸入1.5 毫升离心管,用1000 rpm的转速离心10分钟,移除上清液体并收集细胞球体做分析。

D、收集单颗细胞准备程序

在分离单细胞前,先按上述溶胶与收集细胞球体准备程序进行操作

1. 添加trypsin-EDTA并与收集的细胞球体于37°C混合反应。

2. 用1毫升移液管混合,直到细胞体完全分解。

3. 待细胞球体完全分解,加入3倍体积的1X PBS,并用1000转的转速进行离心10分钟,并移除上清液体收集沉淀的单细胞做分析。

E、细胞迁移实验准备程序

1. 准备Transwell装置及无血清DMEM细胞培养液 (用于稀释A胶)。

2. A胶 (2X) (货号:B-P-00002-A) 置于37 ℃水浴槽回温10分钟,确认完全融解。

3. 用无血清DMEM细胞培养液将A胶 (2X)稀释50倍。

4. 根据Transwell上室底部面积加入100-120 ul/cm2稀释后的A 胶稀释液到Transwell上室中。

5. 将步骤4在4 ℃冰箱孵育30分钟。

6. 将多余的稀释液吸出,并在Transwell上室中加入无血清的癌细胞系细胞悬浮液使细胞浓度约7.5 x 104 cells/well.。

7. 在Transwell下室中加入含10 %血清的细胞培养液做为chemoattractant,吸引癌细胞系进行迁移。

F、小鼠皮下成瘤实验准备程序

1. 将 A胶 (2X) (货号:B-P-00002-A) 置于37 ℃水浴槽回温10分钟,确认完全融解。

2. 将C缓冲溶液(10X) 货号:B-P-00002-C)与冰的无血清细胞培养液 (例如: 无血清DMEM或内含VEGF、heparin的无血清DMEM) 按1:4比例均勻混合配置。(例如:1 ml C缓冲溶液(10X) 與 4 ml 无血清DMEM混合,不可用PBS稀释)

3. 将 A胶 (2X) 与约2*106 cells/ml的癌细胞系悬浮液按1:1等比例均匀混合配置,癌细胞系悬浮液最终浓度约为106 cells/ml。

4. 选用21-25 G的针头 (避免破坏细胞),抽取0.2-0.3 ml 预冷稀释后的C缓冲溶液。(C缓冲溶液用于A胶成胶反应)

5. 使用步骤4的同一支针管,再抽取0.1-0.7 ml含细胞的A胶混合液,在冰上孵育五分钟。

6. 以皮下注射方式注射0.3-1.0 ml至小鼠。(需一次注射完含C缓冲溶液的A膠混合液)

注1: 注射体积可依不同实验目的做调整,若为血管生成研究注射体积需至少0.5 ml。

注2: 此步骤依实验需求可执行或不执行,若需呈现明显的皮下注射隆起效果,可于注射完毕后,在小鼠注射部位冰敷5-10分钟

,若需呈现明显的皮下注射隆起效果,可于注射完毕后,在小鼠注射部位冰敷5-10分钟。

7. 培养一至三周后可摘取接种的肿瘤组织。

注3: 若为血管生成研究,应注射含VEGF及heparin的A胶,以促进血管生成。约三天后,可摘取含有新血管生成的肿瘤组织。

案例分享

A.形成3D肿瘤球体成功案例分享

B.Biozellen基质胶被溶解后分离的完整3D细胞结构照片

培养后的3D细胞球体, 在Biozellen基质胶被试剂盒里面的

D Buffer溶解分离后仍然可以得到完整的3D细胞结构


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