产品货号: K009-100、K009-500、K009-1000、K009-3000

产品规格: 100T/500T/1000T/3000T

产品品牌:Zeta Life

产品概述：

CellCounting Kit简称CCK试剂盒，是一种基于WST（水溶性四唑盐，化学名：2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2,4-二磺基苯）-2H四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

CCK是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其他MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点：

-CCK被线粒体内的脱氢酶还原成的formazan是水溶性，不需要有特定的溶解液来溶解，而WST和XTT、MTS产生的formazan都不是水溶性的，因而可以省去后续溶解步骤。

-CCK比XTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳定。

-CCK和MTT、XTT等相比线性范围更宽，灵敏度更高。

CCK毒性：CCK和其他检测方法相比，对细胞几乎无毒性，不伤害细胞，细胞可重复利用。

CCK应用：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏实验。

操作说明：

一、制作标准曲线(测定细胞具体数量时)

1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。

2、按比例(例如：1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。

3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，OD值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间)。

二、细胞活性检测

1、在96孔板中接种细胞悬液(100ul/孔)。将培养板放在培养箱中预培养(在37℃，5% CO2的条件下)。

2、向每孔加入110ul的CCK 溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。

3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

5、如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10ul 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。

三、细胞增值-毒性检测

1、在96 孔板中配置100ul的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时(在37℃，5% CO2的条件下)。

2、向培养板加入10ul不同浓度的待测物质。

3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如：6、12、24或48小时)。

4、想每孔加入10ul CCK溶液(注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。

5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

7、如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10ul 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基(除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基)，去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

备注：

① 建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK试剂后的培养时间。

② 有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔减的差异。加入

CCK试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基页面下加，容易产生气泡，会干扰OD值读数。

③ 白细胞可能需要培养较长时间。

④ 当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/孔(100ul培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500个/孔(100ul培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK溶液。

⑤ 如果没有450nm的滤光片，可以使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片，但是450nm滤光片的检测灵敏度最高。

⑥ 培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

活力计算：

细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100

A(加药)：具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度

A(空白)：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度

A(0加药)：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

保存条件：

4℃避光保存，有效期一年。

美国Zeta Life公司成立于1989年，是无血清细胞培养基DMEM/F12主要完成人，有三十多年的胎牛血清、无血清细胞培养基、以及干细胞、免疫细胞及肿瘤细胞等多种不同类型哺乳动物细胞的无血清培养液生产经验；也是目前世界胎牛血清、无血清培养基最大的供应商之一；每批血清均有完整的血源证明文件、兽医师检验证明及品质测试报告；

2018年美国Zeta Life公司与美国加利福尼亚大学旧金山校区联合开发活细胞、活体动物体转染试剂，此技术成为蛋白功能、免疫细胞及干细胞治疗、研发及生产的主要关键技术之一。