Catalog No. B-P-00002-2、B-P-00002-4、B-P-00002-10

Specification 2ml-kit、4ml-kit 、10ml-kit

Storage 4℃保存、 保存两年

3D细胞球体培养试验步骤：

A、试剂制备

1、A基质胶：将A基质胶溶于37℃水浴槽回温10分钟， 确认*融解.

2、C缓冲溶液(1X)制备：使用前将10X C缓冲溶液用冰的无细胞培养液(例如： 无血清DMEM、opt-MEM) 制备成 1X C 缓冲溶液。(不要用 PBS 稀释 C 缓冲液) .

3、D 缓冲溶液(1X)制备: 使用前用冷的 1x PBS 稀释 10X D 缓冲溶液至 1X D 缓冲溶液.

B、Biozellen®3D细胞培养基质胶的制备

全部步骤需要在无菌环境内操作，操作步骤如下：

1、将24孔培养板放置于冰上预冷半小时。

2、细胞计数后取 2×105~2×107 细胞与 0.5 毫升 37℃ 细胞培养基均匀混合，并与0.5毫升37℃ A胶按照 1:1 等比例均匀混合，最终细胞密度1*105~1*107cells/mL。

注：请选择适当的培养溶液与条件进行试验。

3、取 20-40 微升步骤 2的混合液滴于 步骤 1 预冷的培养板上，胶体将于 5 分钟内成胶。 注: 测试胶体是否成胶，可用微量吸管尖温和的触碰胶体表面进行确认。

4、待胶体成胶后，添加1毫升冰的1X C缓冲溶液，并盖过步骤3 的胶溶液，固定 15 分钟。

5、待15分钟固定后，小心的吸取 C 缓冲溶液并置换为适合此细胞生长之培养基溶液。

6、将含有细胞的胶于37°C 二氧化碳培养箱内进行7~14天的培养，并观察细胞球体的形成，按正常培养基更换频率进行更换操作。

C、溶胶与收集细胞球体准备程序

1、小心的将培养基吸取移除，并用1X PBS进行清洗。

2、小心的将 1X PBS 吸取移除，并添加 1 毫升冰的D缓冲溶液，盖过胶滴于室温反应 5分钟。

3、温和的用1毫升移液管吸取，直到胶滴*溶解。

4、将含有细胞球体的溶液吸入1.5 毫升离心管，用1000 rpm的转速离心10分钟，移除上清液体并收集细胞球体做分析。

D、收集单颗细胞准备程序

在分离单细胞前，先按上述溶胶与收集细胞球体准备程序进行操作

1、添加trypsin-EDTA并与收集的细胞球体于37°C混合反应。

2、用1毫升移液管混合，直到细胞体*分解。

3、待细胞球体*分解，加入3倍体积的1X PBS，并用1000转的转速进行离心10分钟，并移除上清液体收集沉淀的单细胞做分析。