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双荧光素酶报告基因技术介绍
发布时间:2022-02-14   点击次数:232次

技术服务介绍

双荧光素酶报告基因检测是以荧光素(luciferin) 为底物来检测萤火蛟光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化Iuciferin氧化成oyluciferin, 在luciferin氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence) ,可通过荧光测定仪设备测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光,常应用于启动子转录活性调控及miRNA靶基因验证等向研究。

双荧光素酶通常是指萤火蛟光素酶和海肾荧光素。其中荧火蛟光素是从甲虫(Photinuspyralis)中分离得到,分子量为61kDa;而海肾(Renilla) 荧光素酶则是从海肾(Renillareniformis)中分离,分子量为36kDa。这两种酶的区别之一是他们的底物和辅因子不同:萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、 ATP和镁离子同时存在才能发光;而海肾荧光素酶仅需要腔肠素(coelenterazine)和氧气。萤火荧光素酶和海肾荧光素酶的区别之二是发光的颜色不同:萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色,波长550-570nm;而海肾荧光素酶产生蓝光,波长480nm。正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同,所以在双报告实验中得到广泛应用。

双荧光素酶报告基因检测优势:单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响,而双报告基因则通过共转染的"对照"作为内参为试验提供-基准线, 从而可以在zuidachengdu上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响,使得数据结果更为可信。双荧光素酶报告基因检测常用的载体有两种策略。第一种是两种荧光素分别位于两个载体上,第二种是两种荧光素酶位于同一个载体上。以第一种为例,这两种载体分别为pMIR REPORT miRNA载体和pRL-TK载体。经检索发现,pMIR-REPORT miRNA载体是由Ambion开发的载体,它用来克隆插入miRNA靶序列,评估细胞内miRNA功能的载体。

另外的一个载体是pRL-TK载体,这个载体是由Promega开发的,pRL-TK是海肾荧光素酶报告载体,含有SV40增强子,pMIR-REPORT miRNA这个载体主要是用于评估miRNA与靶基因3’UTR的结合,靶基因的3’UTR放在荧光素酶的后面,这个荧光素酶是荧火虫荧光素酶,而pRL-TK这个载体则表达海肾荧光素酶,将这两个质粒共同转染进入293细胞中来检测荧光时,pRL-TK这个质粒起到一个内参的作用。



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