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CHIP染色质免疫沉淀实验过程中的建议
发布时间:2022-02-14   点击次数:141次

染色质免疫沉淀 (ChIP) 是一种用于表观遗传学研究的技术,可以快速反映蛋白质-DNA 相互作用。 想要获得理想的结果,选择适合的抗体固然很关键,ChIP 流程中所有步骤也很重要。 该技术利用了多种分子生物学和蛋白质组学方法。

CHIP免疫沉淀实验原理:

染色质免疫沉淀技术的原理是:在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA的片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定,染色质断裂,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转,DNA的纯化,以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多,结果的重复性较低,所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照,而且对结果的分析也需要有一定的经验。对于刚刚开始使用ChIP技术的研究人员来说,使用成熟的商品化试剂盒和相关的技术服务会达到事半功倍的效果。

CHIP免疫沉淀实验步骤

细胞固定

甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质,蛋白质-DNA,蛋白质-RNA交联,形成生物复合体,防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的,便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度为1%,交联时间通常为5分钟到1个小时,具体时间根据实验而定。值得注意的是,交联时间如果过长,细胞染色质难以用超声波破碎,影响ChIP结果,而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短,则交联不完全,产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。

染色质断裂

交联后的染色质可被超声波或Micrococcal Nuclease切成400~600 bp的片段(用琼脂糖凝胶电泳检测),以便暴露目标蛋白,利于抗体识别。超声波是使用机械力断裂染色质,容易引起升温或产生泡沫,这都会引起蛋白质变性,进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时,要在冰上进行,且要设计时断时续的超声程序,保证低温。另外,超声探头要尽量深入管中,但不接触管底或侧壁,以免产生泡沫。总超声时间也不要太长,以免蛋白降解。

通过五个步骤获得理想 ChIP 结果

CHIP免疫沉淀建议

使用的交联剂类型取决于需要观察的相互作用的类型

交联不充分,以及与甲醛过度交联,会增加背景信号并导致 DNA 丢失

过度交联会影响抗原的结合,掩盖表位,妨碍超声处理

在显微镜下比较样品前后变化,检查细胞裂解的效率

不同类型的细胞有不同严格程度的裂解要求

如果在裂解中使用超声处理,应将染色质置于在冰上并将脉冲限制在 30 秒以内,以避免蛋白质因过热而变性。


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