技术文章您的位置:网站首页 >技术文章 > 生物实验COIP免疫共沉淀实验的注意事项
生物实验COIP免疫共沉淀实验的注意事项
发布时间:2022-03-31   点击次数:187次



COIP免疫共沉淀实验原理

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。这是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用就被保留了下来。假如用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的proreinA就可以吸附抗原达到精制的目的。这样的方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用来确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

COIP免疫共沉淀的优点

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

COIP免疫共沉淀注意事项

(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质一蛋白质相互作用,

多采用非离子变性剂(NP40 或Triton X-100)。 每种细胞的裂解条件是不一-样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS), 细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的

cocktailer。

(2)确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗

体的使用有助于避免污染的发生;.

(3)要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;

(4)确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进

行蛋白质的定位来确定。



©2022  上海创凌生物科技有限公司 All Rights Reserved.  网站地图    管理登陆  技术支持:化工仪器网
在线客服 二维码

扫一扫,关注我们