Biozellen®基质胶 特点：

1、100%植物源材料，无任何动物成分；

2、胺基酸序列100%人源化 ；

3、可调控基质胶硬度进行多种细胞培养；

4、3D细胞/类器官培养种类数量范围更广；

5、无人畜共通病原菌或毒素风险；

6、适用于医疗级生物原料；

7、高活性、高纯度、可融化；

8、2年保存时间；

9、3D培养结束后基质胶可以温和融化，并保留3D细胞/类器官结构完整性；

Biozellen®3D类器官培养基质胶套装

Catalog No. B-P-00003-2、B-P-00003-4、B-P-00003-10

Specification 2ml-kit、4ml-kit 、10ml-kit

Storage Store at-20℃. 1年保存.

一、产品描述

Biozellen®3D类器官培养基质胶套装包含整套基质胶、胶体固定液、胶体溶解液，可应用到3D细胞培养与微环境应用等；本试剂盒操作便利且可调控基质胶硬度进行多种细胞培养测试；植物胶体可快速形成水凝胶， 请操作前详细阅读此使用指南。

（Biozellen®3D类器官培养基质胶材料为植物来源，无动物成分）

二、应用

•3D类器官培养。

•3D细胞球体培养试验

•细胞侵袭

•细胞迁移

•小鼠皮下成瘤

•适合用于3D细胞药物筛检平台

•细胞生长和分化

•代谢/毒理学研究

•体外和体内血管生成分析

三、适用细胞种类

• 原代细胞 • 干细胞

四、试剂盒组分

五、使用步骤：

A、试剂制备

A基质胶：将A基质胶溶于37℃水浴槽回温10分钟， 确认*融解.

C缓冲溶液(1X)制备：使用前将10X C缓冲溶液用冰的无细胞培养液(例如： 无血清DMEM、opt-MEM) 制备成 1X C 缓冲溶液。(不要用 PBS 稀释 C 缓冲液) .

D 缓冲溶液(1X)制备: 使用前用冷的 1x PBS 稀释 10X D 缓冲溶液至 1X D 缓冲溶液.

B、Biozellen®3D类器官培养基质胶的制备

全部步骤需要在无菌环境内操作，操作步骤如下：

1. 将24孔培养板放置于冰箱或者冰上预冷。

2. 细胞计数后取 2×105~2×107 细胞与 0.5ml 37℃ 培养基均匀混合，并与0.5ml 37℃ A胶按照 1:1 等比例均匀混合，最终细胞密度1*105~1*107cells/mL。

注：请选择适当的培养溶液与条件进行试验。

3.取 20-40 微升步骤 2 含细胞的混合 A 胶溶液滴于 步骤 1 预冷的培养板上，胶体将于 5 分钟内成胶。 注: 测试胶体是否成胶，可用微量吸管尖温和的触碰胶体表面进行确认。

4.待胶体成胶后，添加1毫升冰的1X C缓冲溶液，并盖过步骤3 的胶溶液，固定 15 分钟。

5.待15分钟固定后，小心的吸取 C 缓冲溶液并置换为适合此细胞生长之培养基溶液。

6将含有细胞的胶于37°C 二氧化碳培养箱内进行7~14天的培养，并观察细胞球体的形成，按正常培养基更换频率进行更换操作。

C、溶胶与收集细胞球体准备程序

小心的将培养基吸取移除，并用1X PBS进行清洗。

小心的将 1X PBS 吸取移除，并添加 1 毫升冰的D缓冲溶液，盖过胶滴于室温反应 5分钟。

温和的用1毫升移液管吸取，直到胶滴*溶解。

将含有细胞球体的溶液吸入1.5 毫升离心管，用1000 rpm的转速离心10分钟，移除上清液体并收集细胞球体做分析。

D、收集单颗细胞准备程序

在分离单细胞前，先按上述溶胶与收集细胞球体准备程序进行操作

1. 添加trypsin-EDTA并与收集的细胞球体于37°C混合反应。

2. 用1毫升移液管混合，直到细胞体*分解。

3. 待细胞球体*分解，加入3倍体积的1X PBS，并用1000转的转速进行离心10分钟，并移除上清液体收集沉淀的单细胞做分析。

六、细胞侵袭实验准备程序

A、试剂准备:

1、C缓冲溶液 (0.5 X) 制备 : 使用37 ℃水浴回温的无血清细胞培养液 (例如: 无血清DMEM（不可以用PBS稀释）等，用于稀释A胶) 稀释C缓冲溶液 (10 X) (货号: B-P-00003-C)至C缓冲溶液 (0.5 X), 即体积稀释20倍。使用前放置37度水浴槽。 (例如:1 mL C缓冲溶液 (10 X) + 19 ml 无血清DMEM; 如未使用完毕，可保存于4 ℃ 冰箱, 保存一周)

2、A胶 (1X) 制备 : 将 A胶 (2X) (货号: B-P-00003-A) 置于37 ℃水浴槽回温10分钟，确认*溶解。再将37 ℃水浴回温的无血清细胞培养液取 0.5 mL，加至37 ℃已溶解的 0.5 mL A胶 (2X)，配置成1 mL 的 A胶 (1X)。使用前置于37度，可降低A胶黏度。(单次使用，勿重复冷冻解冻 A胶 (1X) )

B、细胞侵袭实验步骤

1、准备适用24孔板的Transwell装置(例如:康宁Transwell insert, 8 μm PET membrane)。

2、用37 ℃已回温的C缓冲溶液 (0.5 X)将A胶 (1X) 原液体积稀释5-20倍，建议一开始可选用15倍。 (根据细胞种类做稀释比例对比实验，找出适合自己实验体系的稀释倍数，稀释倍数越高，胶体越软，越容易穿透)

3、根据Transwell上室底部面积加入步骤2的 0.1 mL 稀释后的A胶稀释液到Transwell上室中。

4、将步骤4在 4 ℃ 冰箱孵育2-3小时。

5、在Transwell上室中加入0.1 mL 无血清的细胞悬液，使细胞最终浓度约7.5 x 104 cells/well.。

6、在Transwell下室中加入0.8 mL 含10 %血清的细胞培养液做为chemoattractant，吸引细胞进行迁移及分泌基质蛋白酶 (MMP) 侵袭。 (对照组为Transwell下室中加入含0.8ml无血清的细胞培养液)。

7、将细胞培养板在37 ℃, 5 % CO2培养箱孵育24-48 小时。

8、移除培养液，以PBS 清洗2次。

9、用棉签轻轻擦掉上层未迁移的细胞。

10、加入1 ml 100 % 甲醇室温固定30分钟,再以PBS 清洗2次。

11、加入 1 ml 0.1 % 结晶紫染液 ( 0.1 % (g/ml) PBS 结晶紫) 室温染色20 分钟，再以PBS 清洗2次。

12、将Transwell移至载玻片上，在显微镜下随机6-9个视野观察计算迁移的细胞数。

七、小鼠皮下成瘤实验准备程序

A、细胞房内材料准备、试剂制备及步骤

(1) 材料准备:

1. 冰盒、2. 37 ℃ 水浴槽、3. C缓冲溶液(10X)、4. 无血清细胞培养液 (例如: 无血清DMEM，DMEM-F12等，不可用 PBS )、5. A胶 (2X)、6. 细胞培养液、7. 23-26G针头、8. 1 mL针筒、9. 细胞。

(2) 试剂制备:

1、C缓冲溶液 (0.5 X) 制备 : 使用 37 ℃ 水浴回温的无血清细胞培养液 (例如: 无血清DMEM或DMEM-F12等，不可用 PBS ) 稀释 C缓冲溶液 (10 X) 至 C缓冲溶液 (0.5 X), 即体积稀释20倍。使用前放置37度水浴槽。(例如:1 mL C缓冲溶液 (10 X) + 19 ml 无血清DMEM; 若未使用完毕，可先保存于4 ℃ 冰箱, 保存一周)

2、A胶 (1X) 制备 : 将 A胶 (2X) (货号:B-P-00003-A) 置于37 ℃ 水浴槽回温10分钟，确认*溶解。再将 37 ℃ 水浴回温的无血清细胞培养液取 0.5 mL， 加至 37 ℃ 已溶解的 0.5 mL A胶 (2X)，配置成 1 mL 的 A胶 (1X)。使用前置于37度，可降低黏度。 (单次使用，勿重复冷冻解冻 A胶 (1X) )

(3)步骤:

1、取细胞溶液离心后收集细胞沉淀，与C缓冲溶液 (0.5 X) 均匀混合使细胞浓度为3*106 cells/mL。

2、A胶 (1X) 与步骤 1 含 C缓冲溶液 (0.5 X) 的细胞系悬浮液，按照 2:1 比例均匀混合配置，细胞悬浮液最终浓度为 106 cells/mL。使用前置于37℃，可降低黏度。 (C缓冲溶液用于A胶凝胶反应，例如0.5ml C 缓冲溶液(0.5 X)含细胞 加入 1ml A胶 (1X) 混合成1.5ml 的注射液)

3、选用 23-26 G 的针头 (建议选用 24 G) 及 1 mL 针筒，抽取 步骤2 A胶与 C缓冲溶液的细胞混合液至所需注射体积 (例如:0.2-0.6 mL) 。室温37℃至20℃操作抽取。 (若抽取时发生塞针状态，可先把针头拔掉，以针筒进行抽取，建议一次抽取配置好所需针筒数量，避免步骤2 溶液过度凝胶，发生塞针)

4、将抽取好步骤 3 的针筒，带入动物房, 若短时间无法施打建议置于冰上。

B、动物房内材料准备及步骤

(1)材料准备:

1. 含 A胶与 C缓冲溶液的细胞混合液的针筒、2. 皮肤消毒剂 (例如 : 酒精)、

3. 手套、4. 实验小鼠、5. 麻醉小鼠的试剂

(2)步骤:

1、室温下可直接注射。若是置于冰盒上的针筒，回到室温后，待液化再进行注射。 含 A胶与 C缓冲溶液的细胞混合液的针筒，以皮下注射方式，注射实验所需的体积至实验鼠 (建议皮下注射量为 0.2 mL，实际状况依需求而定)。(针筒放冰上注射阻力会上升, 放室溫会液化注射阻力小。注射时若因凝胶缘故而阻力变大，需缓慢注射避免针头喷落)

注1 : 注射体积可依不同实验目的做调整，若为皮下血管生成研究注射体积需至少0.5 mL以上。

注2 : 此步骤依实验需求可执行或不执行，若需呈现明显的皮下注射隆起效果，可调整2.试剂制备将C缓冲溶液 (10 X) 稀释15倍，变成C缓冲溶液 (0.66 X)，再执行后续成胶实验；提高C浓度，可提高胶体硬度。

2、培养一至三周后观察量测接种的肿瘤尺寸。

注3 : 若为血管生成研究，应注射含VEGF及heparin的A胶，以促进血管生成。约三天后，可摘取含有新血管生成的肿瘤组织。