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HumaMatrix新型人源细胞外基质(ECM)的临床应用前景
发布时间:2022-07-08   点击次数:225次

类器官——源自干细胞或祖细胞的细胞聚集体,体现部分器官功能的微缩模型——在发育生物学和医学中受到越来越多的关注。目前,类器官已被广泛用于肝脏、肠道、大脑和胰腺等器官和组织的研究中,作为器官替代物来研究基础和发育生物学、遗传性疾病成因和治疗中的问题。


迄今为止,文献报道的许多类器官都是在Matrigel中培养的。Matrigel来源于Engelbreth Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞的分泌物,制备工艺简单,成本低廉,在3D细胞培养中得到了广泛的应用。而蛋白质组学结果表明,Matrigel含有1800多种蛋白质,——由此可以看出,Matrigel成分复杂,这大大加剧了类器官结构和功能研究的难度。此外,Matrigel的批次不稳定也使类器官实验结果的重复性大打折扣。与此同时,出于免疫原性的考虑,动物来源的Matrigel在疾病建模和临床研究中的应用也受到了限制。基于上述原因,对既能满足类器官培养要求、又能满足临床研究要求的新型基质的需求越来越多。而无异源基质胶正是满足这些要求的理想选择。

无异源基质胶是由溶解的人源组织制备的细胞外基质水凝胶(ECM)。在制备过程中,保留了天然组织的部分生物学活性,促进了其中培养的类器官的结构和功能重塑。此外,这类水凝胶保留了细胞外微环境的组织特异性,相比Matrigel,可以更好支持各种组织来源细胞的生长;其源于人源组织的特性,也大大减少了临床应用中的免疫原性问题。无异源基质胶的这些优点,使其具有重要的临床应用优势,进而大大推动再生医学技术和组织工程的进步。

人源ECM的凝胶化和表征

首先验证HumaMatrix(一种源自人源的细胞外基质)在遵循凝胶化方案时可以成功地制备成水凝胶,首先用HCl 溶液溶解HumaMatrix粉末,用NaOH调节pH 至中性,静置到接近生理温度。实验组的人源 ECM 水凝胶在不同浓度(3、4、5、6、7 和 8 mg/mL)下都制备成水凝胶;用三个批次的HumaMatrix在8 mg/mL的浓度下,约 30 分钟都制备成水凝胶。

图1. 不同浓度的人源ECM形成水凝胶

其次,去细胞化和凝胶化的处理方法,有效保留了人源ECM成分,如胶原蛋白、弹性蛋白,且仍含有糖胺聚糖。与传统3D培养系统(例如Matrigel)相比,人源ECM基质胶所含成份和三维结构明显不同。为进一步研究HumaMatrix的结构,进行扫描电镜分析。

图2. 显示HumaMatrix的扫描电镜 (SEM) 图像

人源ECM对血管生成的影响

血管生成的测定。根据体外血管生成测定的历史金标准方法,我们比较了分别用Matrigel和hPM(一种源自胎盘的人类细胞外基质)诱导的微血管网络(图 3C)。首先将EC培养物用Matrigel或hPM来培养,然后使用Calcein AM检测以确定活性和网络结构。培养1天后,Matrigel包被的孔板上显示HUVEC形成明确的血管生成小管网络,但在 3 天后,相同的网络结构塌陷成凋亡细胞的球形球(图3A、3C)。虽然在hPM诱导的网络中出现一些细胞死亡,且在延长培养5天后没有观察到细胞凋亡现象。在血管生成的晚期,EC募集平滑肌细胞 (SMC) 以稳定生长的微血管。按照同样的方法评估了hPM和Matrigel对平滑肌细胞形态的影响。有趣的是,在没有HUVEC的情况下,接种到Matrigel上的SMC在1天后形成小管,但在hPM涂层板上,SMC保持典型的“山丘和山谷"形状(图 3D),表明细胞类型之间的分子信号通路存在显着差异 【1】 。

图3. 在hPM 和 Matrigel 包被的组织培养瓶中培养的体外血管生成网络【1】

人源ECM支持hiPSC三系分化

hiPSCs 来源于多种类型的人原代细胞,包括新生儿包皮成纤维细胞、成人真皮成纤维细胞和成人成骨细胞。在多谱系分化之前,使用Tra-1-81对未分化的人多能干细胞进行ICC(图 4a)。如图所示,hiPSCs批次显示Tra-1-81的清晰表达。hiPSC 分为三个阶段以分化出目标谱系(图 4b)。在EB形成期间,hiPSC先转化为特定的谱系;在第二阶段,EB在各种基质上发生了附着、生长和成熟;最终,细胞在第三阶段成熟和扩增以完成向目标谱系的分化【2】。

图4. hiPSC 细胞系的表征和分化示意图【2】

人源ECM用于药物筛选

hPM除了应用在再生医学中,还能用于体外筛选血管生成相关药物【1】。同时也测试了HumaMatrix培养的肠癌类器官筛选相关药物的能力,Matrigel已被广泛用作体外筛选抗血管生成癌症药物的模型和癌症类器官模型,因此用Matrigel作为对照。图5通过比较用TSP-1处理的Matrigel或hPM培养的EC(内皮细胞)生长情况来评估药物对血管生成的抑制作用。其中,TSP-1是一种对血管生成和新血管形成有抑制活性的糖蛋白,是实体瘤抗血管生成治疗的常规用药【1】。我们设计类似实验检测HumaMatrix培养的肠癌类器官在药物筛选中的表现。通过比较Matrigel或HumaMatrix培养的肠癌类器官经过不同浓度的Regorafenib处理后的生长状况,评估类器官对不同药物的敏感性(如图6)。

图5. 使用基于hPM的血管生成实验来筛选抗血管生成肿瘤抑制蛋白TSP-1【1】

图6. 使用不同浓度的Regorafenib处理肠癌类器官来检测类器官对药物的敏感性。

人源ECM的组织相容性

当皮下注射到SD大鼠体内,在生理pH条件下,hPM就会形成水凝胶。注射后20分钟内,在注射位点皮肤下方会出现一个肿块。注射hPM的SD大鼠没有出现严重的炎症反应,例如红斑肿胀和积液。注射后1周对植入物的组织学评估显示,在所有注射hPM的动物中,细胞浸润反应增加。同时,观察到轻微的单核细胞浸润反应,主要表明淋巴细胞和巨噬细胞的参与(图7A-F)。此外,还观察到梭形细胞,这说明可能有成纤维细胞浸润。H&E染色显示皮下植入物周围的炎症反应消退,4周后未发生肉芽肿,表明所有水凝胶均未引起明显的局部毒性,并显示出良好的组织相容性【3】。

图7. HE染色显示,在大鼠皮下植入后 1、2 和 4 周,组织对hPM (A-C) 和胶原蛋白I水凝胶(D-F) 的反应的组织学表现。比例尺=200 μm【3】

总结

小鼠肿瘤细胞衍生的 Matrigel方便购买且易于使用,支持类器官生长和扩增。然而,Matrigel的来源限制了类器官在细胞治疗或组织工程应用中的直接临床转化。显然需要一种根据GMP指南生产的水凝胶替代品。这种替代方案还必须保证类器官的培养和大规模扩增。相关数据表明,人源ECM水凝胶是用于大规模培养类器官的潜在选择,可能释放类器官的巨大临床潜力,推动临床研究中血管生成技术的进步。

参考文献

1. M. C. Moore, V.Pandolfi and P. S. McFetridge. Novel human-derived extracellular matrix inducesin vitro and in vivo vascularization and inhibits fibrosis. Biomaterials. 2015May ; 49: 37–46. doi:10.1016/j.biomaterials.2015.01.022.

2. A. C.Murchison, J. J. Odanga, M. L. Treadwell, E. K. Breathwaite, J. R. Weaver andJ. B. Lee, Int. J. Stem Cells, 2020, 13, 432–438

3. Ning-NingChao,†a,b Jia-Le Li,†a Wei Ding,a Ting-Wu Qin,a Yi Zhang,a Hui-Qi Xiea andJing-Cong Luo. Biomater. Sci., 2022, 10, 2062.

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