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HumaDerm天然人源I型胶原蛋白在3D打印中的应用前景
发布时间:2022-07-22   点击次数:58次

I型胶原蛋白——是人体中普遍存在的一种蛋白质,存在于不同组织中,包括肌肉骨骼组织,如骨骼、肌腱和韧带,以及非肌肉骨骼组织,包括角膜、血管和皮肤。在生理条件下,胶原蛋白分子可以自我组装,聚合形成纤维并形成水凝胶。使用I型胶原蛋白作为生物材料具有几个优点,——生物相容性、生物可降解性以及具有支持细胞附着、生长和分化的生物活性位点等。基于这些优势,I型胶原蛋白是一种非常重要的生物材料,也是组织工程应用的材料。


目前,由于易于获得和相对较低的成本,动物来源的I型胶原蛋白(例如牛皮、猪皮、鼠尾)仍然是再生医学应用的常见选择。虽然人源和动物来源的胶原蛋白有一些相似之处,但氨基酸组成的细微差异会影响胶原蛋白的理化特性、细胞应答和组织重塑,并最终影响组织和器官功能。此外,动物来源的胶原蛋白可能引发免疫并发症和疾病传播风险,这也值得注意。

近期的研究报告,使用了美国Humabiologics Inc公司的人体皮肤来源的胶原蛋白——HumaDerm,它是一种应用于组织工程的无异源生物材料。使用人源胶原蛋白可以显著减少FDA审批相关的监管压力,加快科研成果的临床转化。

人源I型胶原蛋白的结构和细胞培养特性

通过SEM成像以定性评估I型胶原蛋白水凝胶的纤维组织结构。牛源及人成纤维细胞和鼠尾I型胶原蛋白水凝胶表现出类似的薄且松散堆积的纤维形态(图1A上排)。相比之下,人皮肤来源的I型胶原蛋白表现出的高密度胶原纤维形态,而人胎盘I型胶原蛋白水凝胶则表现出较低的密度但较粗的纤维。总之,这些结果证实I型胶原蛋白水凝胶中胶原蛋白纤维的组织结构在不同物种、不同组织来源和不同提取方法之间存在很大差异。

通过染色测定法评估接种在I型胶原蛋白水凝胶上的人间充质干细胞 (hMSC)的活力。结果显示在所有测试条件下都具有高细胞活力(图1A下排)。

图1.水凝胶的SEM成像显示不同组织来源、不同物种和提取方法之间,胶原纤维形态存在差异。LIVE/DEAD成像表明,随着时间的推移,hMSC在I型胶原蛋白水凝胶上保持活力。【1】

3D培养和药物筛选

将Caco-2结肠直肠癌细胞包裹在水凝胶基质(I型鼠尾胶原蛋白和I型人皮肤来源胶原蛋白)中。选择鼠尾I型胶原蛋白是因为它通常用于癌症类器官的形成和药物筛选研究。3D肿瘤细胞团暴露于多种浓度的化疗药物中,如5-氟尿嘧啶(5FU)和Regorafenib。这两种药物都是治疗结直肠癌常用的临床批准的化疗药物。在第0天、第1天、第4天和第7天对肿瘤细胞团进行ATP活性定量和活/死细胞染色实验,活/死细胞染色结果与ATP活性数据一致,表明暴露于1μm Regorafenib或5FU的3D肿瘤细胞团随着时间的推移具有升高的ATP活性和扩增calcein-AM阳性细胞,而更高的浓度却得出相反的结果(图2)。值得注意的是,人皮肤组织来源的I型胶原蛋白培养的3D肿瘤细胞团在ATP活性和细胞活力方面对Regorafenib与5FU的反应表现出更明显的差异。这些差异可能影响3D肿瘤模型开发、药物筛选应用的成功或失败。

图2.结直肠癌的LIVE/DEAD可视化3D细胞团的增长情况与之前的定量数据相互验证,表明3D肿瘤细胞团在很大程度上以剂量依赖方式对化疗药物作出反应。实验中,1、10和100 μm浓度给药后的第1、4和7天,用calcein AM(绿色)和ethidium homodimer-1(红色)染色的结直肠癌Caco-2 3D细胞团的荧光显微镜图像(n=3)。条件包括瑞戈非尼(上)和5-氟尿嘧啶(下)处理的 I 型鼠尾胶原蛋白和人皮肤来源I型胶原蛋白3D肿瘤细胞团。用calcein AM染色的绿色活细胞,用ethidium homodimer-1染色的红色死细胞。比例尺1:100 μm。【1】

血管形成能力

比较人源和非人源I型胶原蛋白在SCID/bg小鼠模型中促进体内血管形成和灌注的能力。通过外植体时的检查,鼠尾或人皮肤来源的I型胶原蛋白水凝胶似乎是高度血管化的(图3A下排)。植入前和移植后水凝胶重量的测量表明,与大鼠尾I型胶原蛋白相比,人皮肤来源的I型胶原蛋白凝胶在14天内的重量减轻显著增高(p<0.05),这是一个潜在的低保水能力的指标(图3B)。福尔马林固定、石蜡包埋的水凝胶组织切片的H&E染色证实了检查的结果,并在植入后14天在鼠尾或人源I型胶原蛋白水凝胶中发现了大量微血管(图 3C上排)。与人皮肤来源 I型胶原蛋白水凝胶相比,F4/80染色切片的定量表明,小鼠巨噬细胞在I型鼠尾水凝胶中的浸润明显更高(图3C下排,3D)。

图3.鼠尾I型胶原蛋白和人皮肤来源的I型胶原蛋白水凝胶对体内血管形成的影响。(A)水凝胶植入SCID/bg小鼠模型腹壁前和14天后的照片,比例尺1:5毫米。(B)通过在植入时和外植体后测量水凝胶重量来评估凝胶收缩情况。数据显示为均值标准误差(SEM) (n = 3; p<0.05)。(C)植入后14天水凝胶的代表性H&E图像,显示含有水凝胶的鼠尾和人体皮肤来源的I型胶原蛋白支持体内血管形成。F4/80免疫组化分析显示小鼠巨噬细胞有不同程度的浸润。插图代表水凝胶横截面的低放大率视图。比例尺1:500 μm。(D) F4/80+染色面积的定量结果表明,在人皮肤来源的I型胶原蛋白的水凝胶中,浸润程度特别高(*表示p<0.05)。【1】

细胞3D打印

3D生物打印是一种逐层制造技术,生产负载细胞的组织结构,精确控制其几何形状及引起细胞反应的生化指标的空间分布。结果表明,6mg/ml的人源胶原蛋白可以获得高形状保真度的组织块,且不需要进一步修饰(图4(a))。另一方面,使用异源胶原打印的组织结构不稳定,并在FRESH支撑浴熔化时塌陷(图4(a))。这种结果差异原因在于剪切力的不同,而这种剪切力在FRESH熔化过程中诱导了异源胶原结构体的碎裂。

一个更合理的解释是,人源胶原蛋白中的超组织纤维状结构能够更好地承受剪切力,从而在FRESH支撑浴熔化后保持打印结构的形状保真度。此外,与异源胶原不同,在FRESH介质中打印具有3mg/ml人源胶原的结构是可行的。细胞活力结果表明,悬浮在人源胶原蛋白生物墨水中的细胞在打印后仍然有活力(图4(b)和(c))。高细胞活力(即没有红色染色)原因在于印刷过程中较低的生物墨水粘度和减少的剪切应力。此外,与第1天相比,第7天的细胞密度明显更高,这表明细胞在打印的胶原蛋白结构中随着时间的推移而增殖。总之,这些结果表明人源胶原蛋白可用负载细胞的3D生物打印用的有效生物墨水。

图4.使用人源和异源胶原生物墨水的3D打印结构。(a)使用3mg/mL和6mg/mL胶原蛋白生物墨水打印的网格结构的3D模型和图像,在从FRESH介质中取出前后,(b) 第1天细胞状态,和 (c) 第7天细胞状态.比例尺1:200毫米。【2】

总结

研究中测试的商业可用的各种I型胶原蛋白,不同来源具有不同的机械、生化和生物学特性,在开发再生医学疗法时应考虑这些特性差异。仍然需要进一步研究以了解不同胶原蛋白和ECM来源的特性。已有数据表明,与生理和临床相关的人源皮肤I型胶原蛋白可以用作动物来源胶原蛋白的替代品,以更好开发再生医学疗法。

参考文献

1. Baltazar T, Kajave NS, Rodriguez M,et al. Native human collagen type I provides a viable

physiologically relevant alternative to xenogeneic sources for tissue engineering applications: A comparative in vitro and in vivo study. J Biomed Mater Res. 2022;1‐15. doi:10.1002/jbm.b.35080

2. Schmitt T, Kajave N, Cai HH, Gu L, Albanna M, Kishore V. In vitro characterization of xeno-free clinically relevant human collagen and its applicability in cell-laden 3D bioprinting. J Biomater Appl. 2021;35: 912-923. doi:10.1177/0885328220959162

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