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LeapWal PolyShooter 转染试剂产品概述介绍
发布时间:2022-11-08   点击次数:53次

LeapWal PolyShooter 转染试剂 P09110产品概述

细胞转染是指将外源分子导入真核细胞内以改变其基因型或表型的一种技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展,转染已经成为研究和控制基因功能的常规手段,广泛应用于基因功能研究、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等领域。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。其中化学介导方法因其兼具高效低毒、方便快捷等优点,应用广泛。化学介导方法包括经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法以及多种阳离子物质介导的转染方法。

理想的细胞转染方法应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。已有众多文献报道,脂质体本身会参与细胞生理活动,影响基因表达,对研究数据产生一定程度的干扰。同时,脂质体会对目的细胞造成细胞毒性,这种毒性是由其脂质特性决定的。市面上多种商业化的脂质体转染试剂要求细胞铺板密度较高,以90%-95%为佳,这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响。但是,如果研究的基因要求比较长的表达时间,例如细胞周期相关基因,或者细胞表面蛋白,又或者转染后续需要进行继续培养和功能研究,则不适合用脂质体核酸转染试剂。目前众多的研究者和生物公司将新一代转染试剂的开发聚焦在非脂质体的聚合物上,以寻找更高效低毒,同时对研究影响较小的转染试剂。

LeapWal PolyShooter转染试剂,即PolyShooter Transfection Reagent是一种基于阳离子高分子聚合物的新型转染试剂,适用于DNA、RNA的转染。其原理为带正电的高分子聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后,与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用,并通过内吞作用进入细胞,随后在胞质中释放,实现外源核酸的细胞转染。

LeapWal PolyShooter 转染试剂 P09110对多种常见细胞具有高水平转染效率,具有高效低毒、操作简单、重复性好等优点。其*的配方使其可直接加入培养基中,血清的存在不会影响转染效率,这样可以减少去除血清对细胞的损伤。同时,转染后不需要除去PolyShooterTransfectionReagent-核酸复合物或更换新鲜培养基,也可根据具体情况优化转染体系。

02/产品组分

03/保存条件

冰袋(wetice)运输。4℃保存,有效期6个月。-30℃至-10℃保存,有效期12个月,避免反复冻融。

04/产品特点

优秀的转染效率——针对广泛类型的细胞,均表现出优秀的转染效率和高重组蛋白表达水平

细胞毒性低——作用温和,能较好地实现高转染效率与低细胞毒性之间的平衡

操作简单——在血清存在时亦具有可靠的转染效率,转染后无需去除复合物或更换新鲜培养基

高性价比——经济的价格,同时实现高效的转染效果

05/适用范围

PolyShooter Transfection Reagent 采用阳离子高分子聚合物为主要成分,适用于DNA、RNA的转染。

06/实验流程概要

07/实验步骤(以24孔板为例,其他培养板加样体积参考表一:转染量度标准)

1:准备待转染细胞

贴壁细胞:转染前一天,将消化后的细胞按照每孔0.3-2x10^5个细胞的量进行铺板,使其在转染时密度为50%-60%。

悬浮细胞:转染当天,配制转染试剂-核酸复合物之前,在24孔板中进行细胞铺板,每500µL生长培养基中加入2-5x10^5个细胞。

Ø细胞状态会极大影响转染效率,待转染细胞应处于良好生长状态,建议使用生长处于指数期、存活率大于90%的细胞进行转染。

2:准备PolyShooter转染试剂-核酸复合物

(1)取1μg质粒加入到1.5mL离心管中,加入2.5μL*PolyShooter转染试剂与质粒混合,室温孵育3分钟。

Ø*转染试剂使用量受细胞类型及其他实验条件影响,通常情况下,DNA(μg)和PolyShooter转染试剂(μL)的用量比例为1:2.5。建议初次使用时,可在1:2-1:5的范围内调整以优化转染效果。

(2)往上述混合物中加入100μL无血清基础培养基(与培养体系一致,且无血清无双抗),轻轻混匀,在室温下静置30分钟,形成PolyShooter转染试剂-核酸复合物。

ØPolyShooter转染试剂-核酸复合物在室温下4个小时内保持稳定。

3:细胞转染

给细胞更换新鲜的预热的*培养基500μL/孔,将上述100µLPolyShooter转染试剂-核酸复合物加入每孔细胞,轻轻摇动培养板混匀。

Ø对于悬浮细胞系:转染5小时后,可选择加入PMA和/或PHA以提高CVM启动子的活性并促进基因表达。对于Jurkat细胞,PHA和PMA的终浓度分别为1µg/mL和50ng/mL,可以提高CMV启动子活性和基因表达。对于K562细胞,只加入PMA足以提高启动子活性。

4.分析转染细胞

转染细胞培养24-48小时后,可根据实际情况用荧光检测法、WesternBlot、RT-PCR、ELISA、流式细胞术、报告基因等检测转染效果,或加入筛选药物进行稳定细胞株的筛选。

08/注意事项

1.核酸质量:想要获得最高的转染效率和更低的细胞毒性,应选用高纯度、无菌、无污染、无内毒素的优质核酸。质粒中的内毒素是转染的大敌,内毒素会导致转染效率显著下降,特别是对内毒素敏感的细胞,例如原代细胞、悬浮细胞、造血细胞等。推荐使用无内毒素质粒抽提试剂盒进行质粒提取,保证质粒A260/A280比值为1.8-2.0。同时,需合理计算质粒用量,转染过量的质粒可能会导致细胞毒性甚至死亡;

2.细胞质量:细胞状态会极大影响转染效率,建议使用生长处于指数期、存活率大于90%的细胞进行转染;

3.细胞密度:建议细胞传代后12-24h内、细胞密度为50%-60%时进行转染。不同的细胞转染实验,对细胞密度的要求不尽相同。在进行不同核酸或不同细胞系的转染时,需要根据说明书再次优化实验条件。此外,在实验过程中保证相同的接种条件,确保实验数据的可重复性;

4.质粒与转染试剂使用比例:对于大多数细胞系,转染复合物中DNA(μg)与PolyShooter Transfection Reagent(μL)的比例在1:2至1:5之间,推荐比例为1:2.5。想要获得转染结果,需要对这一比例进行优化,根据所转染细胞及质粒选择适合的转染比例;

5.PolyShooter Transfection Reagent可用于有血清培养基的转染,并且转染前后不需要换培养基。但是,制备转染复合物时要求用无血清基础培养基稀释DNA和转染试剂,因为血清会影响复合物的形成;

6.由于一些特殊培养基中的某些成分可能会抑制阳离子聚合物介导的转染,因此有必要检测特殊培养基与PolyShooter Transfection Reagent的相容性;

7.为了您的健康安全,请规范操作,穿戴实验服与手套开展实验;

8.本产品仅供科研使用,请勿用于临床诊断及治疗。

09/实验案例分析

1:转染前一天,将图2所示9种状态良好的细胞接种于24孔板,使其在转染时密度约为50%。

2:按照每孔计量,取1μgGFP质粒加入到1.5mL离心管中,加入2.5μL PolyShooter Transfection Reagent与质粒混合,室温孵育3min后,往混合物中加入100μL无血清基础DMEM培养基,轻轻混匀,在室温下静置30min,形成PolyShooter转染试剂-核酸复合物。

3:给细胞更换新鲜的预热的*培养基500μL/孔,将上述100µLPolyShooter转染试剂-核酸复合物加入每孔细胞,轻轻摇动培养板混匀。

4:转染细胞培养48小时后,用荧光显微镜检测GFP绿色荧光蛋白表达情况,并拍照记录,实验结果如图2所示。

图2:转染细胞培养48小时后,用荧光显微镜检测GFP绿色荧光蛋白表达情况



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