优化、培养原代LYCO和LYCT细胞条件技术分享

原文标题：Establishment and characterization of the gonadal cell lines derived from large yellow croaker (Larimichthys crocea) for gene expression studies.

 Doi: 10.1016/j.aquaculture.2021.737300

发表文章单位：集美大学水产学院农业农村部东海海水健康养殖重点实验室     

背景：鱼类细胞系在资源保护、遗传育种、疾病防治、环境污染物检测等方面具有重要的应用价值。性腺细胞系的建立将为研究性别决定的分子调控机制以及性别相关基因的表达和功能提供合适的体外模型。

方法：采用改良Leibovitz L-15培养基，从幼鱼的卵巢和精巢中分别建立了大黄鱼卵巢细胞系（LYCO）和精巢细胞系（LYCT）。再通过优化培养基条件以提高LYCO和LYCT的生长速度和增殖能力，包括ZETA-life胎牛血清（FBS）浓度、不同传代比例、冻存和复苏等。

结果：采用电穿孔法成功地将pEGFP-N1和pNanog-N1转染到细胞系中，细胞的转染效率较高，表明该细胞系可用于研究外源基因和内源基因的表达。LYCO表达卵泡细胞的标记基因Foxl 2，而LYCT表达睾丸支持细胞的标记基因Dmrt 1，且LYCO和LYCT不表达生殖细胞标志基因Vasa。表明LYCO和LYCT分别由卵泡细胞和睾丸支持细胞组成。在LYCO和LYCT中分别敲低Dmrt 1和Foxl 2后，获得的细胞系可有效用于RNA介导的干扰（RNAi）实验和基因间相互作用的研究。

结论：作为第一个获得的鱼类性腺细胞系。本研究为大黄鱼体细胞与生殖细胞的相互作用提供了一种新的模型，为大黄鱼生殖细胞的进一步研究奠定了基础。本研究结果为今后海水鱼类性腺细胞培养的研究奠定了基础。
文章引用：

Primary culture and subculture

When the primary cells were fully expanded, the subculture was started with a 0.25% trypsin digestion method, and the cell culture bottle was gently turned back and forth. The trypsin was sucked out after most of the cells became round, then 3 mL of new culture medium and 2mL of old culture medium were added again. The cells were gently transferred to the new culture bottle for constant temperature culture.The FBS (Zeta-life, Australia Origin, Z7010FBS-500) concentration remained at 16.7% in the early stage of cell culture and gradually decreased to 10% FBS when the cells were passed to passage 20 (P20),and the morphology turned good. During the first 30 subcultures, the cells were split at a ratio of 1:2 every 2–3 days.    

结果引用:

以澳洲胎牛血清FBS (Zeta-life, Australia Origin, Z7010FBS-500)血清进行的LYCO和LYCT的原代培养.A和B分别表示第2天和第5天的LYCO原代培养细胞; C和D分别表示第5天和第7天的LYCT原代培养细胞。随着传代的进行，LYCO主要由卵巢体细胞和生殖细胞（卵细胞等）组成。继代培养后，LYCT的形态没有明显变化，扩增速度加快。3-4 d内子代细胞覆盖率达100%。目前，细胞已稳定传代至第80代（P80）。

E和F分别显示在LYCO和LYCT中用pNanog-N1转染后的绿色荧光蛋白（GFP）。检测到强烈的绿色荧光信号，证明转染效率高。G表示用不同浓度的澳洲胎牛血清FBS(Zeta-life, Australia Origin, Z7010FBS-500)培养LYCO和LYCT。发现细胞几乎不在含0%和5%FBS的培养基中扩增。当FBS浓度为10%、15%、20%时，细胞能正常生长并充分增殖。当FBS浓度为15%或20%时，细胞迅速扩增，覆盖率可达90%。因此，在早期细胞培养中，可选择含15%或20% FBS的培养基。

原文培养原代大黄鱼卵巢细胞（LYCO）和大黄鱼精巢细胞（LYCT）方法总结
通过优化培养基条件以提高LYCO和LYCT的生长速度和增殖能力。其中包括使用不同浓度的胎牛血清（FBS，Zeta life, Australia Origin, Z7010FBS-500）来进行优化，为研究出最佳LYCO和LYCT的生长速度和增殖能力提供可靠数据。研究证明当FBS浓度为15%或20%时，细胞迅速扩增，覆盖率可达90%。因此，在早期细胞培养中，可选择含15%或20% FBS的培养基。

引用产品

胎牛血清fetal bovine serum (Zeta life, USA) ；

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ZETA life FBS（胎牛血清）简介：
  美国ZETA life公司成立于1989年，是国际无血清细胞培养基DMEM/F12主要完成人，有几十年的胎牛血清、无血清细胞培养基、以及干细胞、免疫细胞及肿瘤细胞等多种不同类型哺乳动物细胞的无血清培养液生产经验；ZETA life也是目前世界胎牛血清、无血清培养基最大的OEM供应商之一；每批血清均有完整的血源证明文件、兽医师检验证明及品质测试报告；ZETA life胎牛血清在100级的无菌间采用全自动方式制造生产，具有良好的可再现性及可追溯性。