双荧光素酶检测报告实验步骤及原理

一、实验原理

利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特点，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断性刺前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。

同时，为了减少内在的变化因素对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinilla luciferase)的质粒作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。

二、实验材料

1. 实验器材

2. 试验主要试剂

三、实验操作步骤：

DLA检测

1. 细胞培养及细胞传代

1. 倒置显微镜观察细胞，评估细胞汇合的程度以及确认无细菌和真菌污染；
2. 移去培养皿（瓶）中的培养液；
3. 加入相当于培养液体积一半的PBS清洗单层细胞，一般三次即可；
4. 按1ml/25cm2表面积的量加入0.25%胰酶消化单层细胞。摇晃培养皿（瓶）使其胰蛋白酶覆盖细胞单层，倒出多余的胰蛋白酶；
5. 将培养瓶放回培养箱，放置2-10 min;
6. 用倒置显微镜观察细胞以确保所有细胞都分离且漂浮，轻拍培养皿（瓶）的一侧来释放残留的贴壁细胞；
7. 用少量的含新鲜血清的培养液重悬细胞以灭活胰蛋白酶，取出100-200μl用于计数；
8. 将所需数量的细胞移至一个新标记好的温育过培养液的培养皿（瓶）中；选择适当培养条件培养细胞系；
9. 按照细胞系的生长特性重复该步骤，知道细胞状态良好、无污染，可以铺板使用，其余选择冻存。

1. 活细胞计数

1. 取一瓶传代的细胞，待长成单层以后使用；细胞悬液的制备方法：用0.25%的胰酶消化、PBS洗涤后，加入培养液吹打制成待测细胞悬液。
2. 盖好盖玻片，取一套血球计数槽，制备计数用的细胞悬液：用吸管吸适量细胞悬液到离心管中，加入等体积台盼蓝染液，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。若仅是单纯的进行细胞计数，不考虑细胞的活力，则可不使用台盼蓝染色。
3. 将细胞悬液滴入计数板，注意盖玻片下不要有气泡，也不要悬液流入旁边槽中。
4. 统计四个大格的细胞数，将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的大格（每格含有16个中格）中没有被染液染上色的细胞数目。
5. 计算原细胞悬液的细胞数。按照下面公式计算细胞密度：
6. （细胞悬液的细胞数）/ml = (四个大格子细胞数/4）×2×10⁴

1. Dual-Luciferase® Reporter Assay试剂盒检测步骤

1. 细胞转染：按照上述实验分组的情况，采用lipo2000转染试剂盒的方法进行质粒转染，转染12小时后更换新鲜培养基；
2. 样品裂解：转染72小时后PBS清洗细胞两次，每孔加入250ul 1×PLB裂解液，摇床上裂解细胞；
3. 样品检测：在96孔黑色板中加入100ul的LAR II试剂，后加入20ul的裂解液后检测读数；
4. 内参检测：10s内加入100ul的Stop & Glo底物，检测读数；
5. 结果分析：导出数据后采用GraphPad prism 5软件进行结果分析并制图；