荧光定量PCR实验检测

实验原理

实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

二、实验操作步骤：

1. 细胞培养及细胞传代

1. 倒置显微镜观察细胞，评估细胞汇合的程度以及确认无细菌和真菌污染；
2. 移去培养皿（瓶）中的培养液；
3. 加入相当于培养液体积一半的PBS清洗单层细胞，一般三次即可；
4. 按1ml/25cm2表面积的量加入0.25%胰酶消化单层细胞。摇晃培养皿（瓶）使其胰蛋白酶覆盖细胞单层，倒出多余的胰蛋白酶；
5. 将培养瓶放回培养箱，放置2-10 min；
6. 用倒置显微镜观察细胞以确保所有细胞都分离且漂浮，轻拍培养皿（瓶）的一侧来释放残留的贴壁细胞；
7. 用少量的含新鲜血清的培养液重悬细胞以灭活胰蛋白酶，取出100-200μl用于计数；
8. 将所需数量的细胞移至一个新标记好的温育过培养液的培养皿（瓶）中；选择适当培养条件培养细胞系；
9. 按照细胞系的生长特性重复该步骤，直到胞状态良好、无污染，可以铺板使用，其余选择冻存。

2.活细胞计数

1. 取一瓶传代的细胞，待长成单层以后使用；细胞悬液的制备方法：用0.25%的胰酶消化、PBS洗涤后，加入培养液吹打制成待测细胞悬液。
2. 盖好盖玻片，取一套血球计数槽，制备计数用的细胞悬液：用吸管吸适量细胞悬液到离心管中，加入等体积台盼蓝染液，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。若仅是单纯的进行细胞计数，不考虑细胞的活力，则可不使用台盼蓝染色。
3. 将细胞悬液滴入计数板，注意盖玻片下不要有气泡，也不要悬液流入旁边槽中。
4. 统计四个大格的细胞数，将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的大格（每格含有16个中格）中没有被染液染上色的细胞数目。
5. 计算原细胞悬液的细胞数。按照下面公式计算细胞密度：

6）（细胞悬液的细胞数）/ml = (四个大格子细胞数/4）×2×10⁴

3.细胞处理

4.RNA提取

1）细胞中加入1ml Trizol，将细胞裂解吸到一个1.5ml的EP管中；

2）加入200ul氯1仿，轻轻颠倒数次混匀，室温放置5分钟；

3）12000rpm，4℃15min 4℃；

4）转上层水相（约400ul）于新1.5ml EP管中，加入400ul异丙醇，混匀，室温静置10min；；

5）12000rpm 10min 4℃；

6）弃上清，沉淀用预冷的70%无水乙醇洗3次，空气干燥5-10分钟，溶于20ulDEPC水中；

7）分光光度计测定RNA浓度。

5.RNA cDNA第.一链合成

1. 将逆转所需要的物品准备好，RNA浓度计算好，tube准备并标记上；
2. 在冰浴的nuclease-free PCR管中加入试剂
3. 轻轻混匀，42度孵育15分钟。
4. 85度加热5秒失活TransScript RT/RI和gDNA Remover。
5. 将上述溶液-20°C保存。

6.荧光定量PCR检测

1. 将cDNA样品稀释10倍作为模板上机检测。
2. 配制反应混合液
3. PCR循环条件
4. 仪器的操作

完成上述步骤后，把加好样品的96孔板放在ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪中进行反应。