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荧光定量PCR实验检测服务
发布时间:2020-09-02   点击次数:90次

荧光定量PCR实验检测

 

实验原理

实时荧光定量PCR Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。

二、实验操作步骤:

1. 细胞培养及细胞传代

  1. 倒置显微镜观察细胞,评估细胞汇合的程度以及确认无细菌和真菌污染;
  2. 移去培养皿(瓶)中的培养液;
  3. 加入相当于培养液体积一半的PBS清洗单层细胞,一般三次即可;
  4. 1ml/25cm2表面积的量加入0.25%胰酶消化单层细胞。摇晃培养皿(瓶)使其胰蛋白酶覆盖细胞单层,倒出多余的胰蛋白酶;
  5. 将培养瓶放回培养箱,放置2-10 min
  6. 用倒置显微镜观察细胞以确保所有细胞都分离且漂浮,轻拍培养皿(瓶)的一侧来释放残留的贴壁细胞;
  7. 用少量的含新鲜血清的培养液重悬细胞以灭活胰蛋白酶,取出100-200μl用于计数;
  8. 将所需数量的细胞移至一个新标记好的温育过培养液的培养皿(瓶)中;选择适当培养条件培养细胞系;
  9. 按照细胞系的生长特性重复该步骤,直到胞状态良好、无污染,可以铺板使用,其余选择冻存。

2.活细胞计数

  1. 取一瓶传代的细胞,待长成单层以后使用;细胞悬液的制备方法:用0.25%的胰酶消化、PBS洗涤后,加入培养液吹打制成待测细胞悬液。
  2. 盖好盖玻片,取一套血球计数槽,制备计数用的细胞悬液:用吸管吸适量细胞悬液到离心管中,加入等体积台盼蓝染液,加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。若仅是单纯的进行细胞计数,不考虑细胞的活力,则可不使用台盼蓝染色。
  3. 将细胞悬液滴入计数板,注意盖玻片下不要有气泡,也不要悬液流入旁边槽中。
  4. 统计四个大格的细胞数,将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察,并移动计数板,当看到镜中出现计数方格后,数出四角的大格(每格含有16个中格)中没有被染液染上色的细胞数目。
  5. 计算原细胞悬液的细胞数。按照下面公式计算细胞密度:

6)(细胞悬液的细胞数)/ml = (四个大格子细胞数/4×2×104

3.细胞处理

4.RNA提取

1)细胞中加入1ml Trizol,将细胞裂解吸到一个1.5mlEP管中;

2)加入200ul氯1仿,轻轻颠倒数次混匀,室温放置5分钟;

312000rpm4℃15min 4℃

4)转上层水相(约400ul)于新1.5ml EP管中,加入400ul异丙醇,混匀,室温静置10min;;

512000rpm 10min 4℃

6)弃上清,沉淀用预冷的70%无水乙醇洗3次,空气干燥5-10分钟,溶于20ulDEPC水中;

7)分光光度计测定RNA浓度。

5.RNA cDNA第.一链合成

  1. 将逆转所需要的物品准备好,RNA浓度计算好,tube准备并标记上;
  2. 在冰浴的nuclease-free PCR管中加入试剂
  3. 轻轻混匀,42度孵育15分钟。
  4. 85度加热5秒失活TransScript RT/RIgDNA Remover
  5. 将上述溶液-20°C保存。

6.荧光定量PCR检测

  1. cDNA样品稀释10倍作为模板上机检测。
  2. 配制反应混合液
  3. PCR循环条件
  4. 仪器的操作

完成上述步骤后,把加好样品的96孔板放在ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪中进行反应。

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