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Seahorse XF实时ATP速率测定
发布时间:2020-11-13   点击次数:34次

 

实验背景

细胞三磷酸腺苷(ATP)的产生速率是一种描述细胞代谢的信息含量很高的测量,因为

ATP是细胞内普遍存在的主要能量货币。细胞的代谢调控使细胞根据ATP需求的变化调整ATP产生的变化来维持总的细胞内的ATP水平。

  安捷伦Seahorse XF实时ATP速率测定被设计用来测量活细胞总的ATP产生速率。更重要的是,这个实验能够区分哺乳动物细胞内两条主要的产生ATP的代谢途径线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)和糖酵解ATP的产生。

     Seahorse XF实时ATP速率测定利用代谢的调节剂(寡霉素(Oligomycin),鱼藤酮(Rotenone)及kang霉素A(Antimycin A)的混合物,见图1),当连续加药后,可以计算线粒体和糖酵解的ATP产生速率。配合Seahorse XFe24,XF96或XFe96分析仪,SeahorseXF实时ATP速率测定通过提供细胞ATP产生速率的实时测量和细胞能量平衡的定量表型为细胞生物能量学提供了一个新的动态和定量的视角。

 

图1. 安捷伦Seahorse XF实时ATP速率测定方案-OCR和ECAR测量的动力学曲线。   首先测量基础OCR和ECAR。加入寡霉素导致线粒体ATP合成受到抑制从而引起OCR减少,使mitoATP产生速率得以量化。ECAR数据结合检测液的缓冲系数可以计算总的质子流出速率(PER)。用鱼藤酮和kang霉素A完全抑制线粒体呼吸能够计算线粒体相关的酸化,结合PER数据能够计算glycoATP产生速率。

   哺乳动物细胞中,糖酵解和氧化磷酸化(OXOHOS)途径提供大部分的细胞ATP。氧化磷酸化消耗O2,驱动氧气消耗速率(OCR),这两条途径都能导致检测液酸化。葡萄糖通过糖酵解转换成乳酸,每分子乳酸伴随着一个H+流出,而TCA循环使ETC/氧化磷酸化产生CO2,也会导致检测液酸化。这些反应的总和是细胞外酸化(ECAR)变化的主要驱动因素。

词汇表

· glycoATP产生速率(glycoATPProduction Rate):糖酵解途径中葡萄糖转变成乳酸相关的ATP产生速率(以pmol ATP/min来表示)。

· mitoATP产生速率(mitoATPProduction Rate):线粒体氧化磷酸化相关的ATP产生速率(以pmol ATP/min来表示)。

· 总的ATP产生速率(Total ATP Production Rate):活细胞在适当的实验条件下线粒体ATP产生速率和糖酵解ATP产生速率之和。

· P/O值(P/O ratio):一对电子通过线粒体电子传递链每还原一个氧原子(O)合成的ATP分子数(即磷酸化为ATP的ADP摩尔)。

· XF ATP速率指数(XF ATPRate Index):在一定时间点,mitoATP产生速率除以glycoATP的比值。这是一个有价值的检测代谢表型变化和/或差异的指标。XF ATP速率指数的增加表示更多的氧化/更少的糖酵解表型,反之亦然。

· 诱导实验(Induced Assay):XF实时ATP速率测定工作流程包含一次在连续注射寡霉素和鱼藤酮/kang霉素A之前的实验化合物急性注射。此工作流程能够测量ATP产生的原位激活或抑制,以及XF ATP速率指数(mitoATP产生速率/glycoATP产生速率)的实时改变。

· 缓冲系数(Buffer Factor):测量系统的缓冲能力,包括检测液和XF实验条件(仪器,探针,实验耗材)。

· 糖酵解(Glycolysis):在Seahorse XF实验中,由葡萄糖转变成乳酸的过程。

· 质子流出速率(Proton Efflux Rate):随着时间的推移,细胞排出到检测液中的质子数,以pmol/min来表示。

· 糖酵解质子流出速率(Glycolytic Proton Efflux Rate):来源于糖酵解的质子流出速率(扣除CO2依赖的酸化的影响)。这个测量指标与细胞外乳酸的产生速率高度相关。

· ATP偶联的呼吸(ATP coupled respiration):基础呼吸中被用来驱动ATP产生的部分。通过注射ATP合酶抑制剂寡霉素进行定量。

 常见问题

§ 如果检测液中含有不同的氧化底物(不同的P/O值),mitoATP产生速率如何计算?

    为了将ATP偶联的呼吸转换为线粒体的ATP产生速率,在电子传递链末端每还原一个氧原子,ADP磷酸化为ATP的化学计量学必须得到确定。不同的底物理论上最大的P/O值不同,并且依赖于化学计量学/底物氧化通路,以及F1FATP合酶的效率。在标准的XF实验条件下,细胞被供给底物混合物(主要是葡萄糖,丙酮酸和谷氨酰胺),且通常内源性底物储备(糖原,脂肪酸,其他氨基酸)可用于线粒体氧化。因此,用几种细胞系进行了测试并确认P/O值2.75准确代表了外源性和内外源性氧化底物混合物的平均P/O值。

 

当进行诱导的XF实时ATP速率测定时,诱导的速率是如何计算和报告的?

     在XF实时ATP速率诱导实验中Summary Printout和Measure Sheet中的 Average Assay Parameter Calculations显示的Induced Rate(s)是用急性注射和寡霉素注射之间所有测量的平均值计算的。然而,每个时间点的诱导速率可以从Kinetic Rate Data(Measure Sheet)中获得。

 

§ XF实时ATP速率测定中定义的XF ATP速率指数是什么?

    XF ATP速率指数是mitoATP产生速率与glycoATP产生速率的比值(即mitoATP rate/glycoATP rate)。这个比值是一个细胞代谢表型的定量指标。代谢指数大于1代表大于50%的细胞ATP来自线粒体的ETC/氧化磷酸化,而指数小于1表示大于50%的总ATP是糖酵解途径产生的。因为代谢指数是比值测量,所以它对于代谢表型的改变或转换是高度敏感的。

 

§ 为什么相同的细胞类型当细胞以不同的密度种板时XF ATP速率不一样?

    细胞的代谢表型会被细胞对ATP的需求所影响。一般来说,处于增殖或分化中的细胞比融合(缓慢生长)或末端分化的细胞拥有更高的糖酵解速率。为了比较实验之间的结果,推荐在整个研究过程中保持一致的细胞培养条件和细胞接种密度。

 

§ 为什么必须用Seahorse XF DMEM培养基,pH 7.4或Seahorse XF RPMI培养基,pH 7.4来进行这个实验?

       GlycoATP产生速率的计算需要对XF实时ATP速率测定中的糖酵解质子流出速率进行绝对测量。为了正确计算PER,检测液必须要有一个固定的缓冲能力。培养基中低浓度的HEPES 在实验的时间范围内提供了一致的缓冲能力值。虽然添加HEPES缓冲液轻微地减少了ECAR信号,但是它显著提高了ECAR数据的质量和一致性,以及转换为PER的准确性(更多详情,请参阅White paper: Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology)。此外,使用预调pH到7.4的XF DMEM或XF RPMI培养基节省了实验准备的时间,确保XF实验过程中一致的检测液pH值。

 

§ 我能够使用其他的Seahorse XF检测液来运行XF实时ATP速率测定吗?

   GlycoATP产生速率的准确计算需要使用一种没有酚红和碳酸氢钠且低浓度HEPES缓冲液的检测液。因此,强烈推荐使用安捷伦Seahorse XF DMEM(或RPMI),pH 7.4的培养基。任何偏离推荐的培养基和补充剂(葡萄糖,丙酮酸钠,谷氨酰胺),需要根据经验(使用XF分析仪)确定每个实验的缓冲系数(参阅Seahorse XF Buffer Factor Protocol以进一步了解信息)。任何含有酚红的检测液不能在XF实时ATP速率测定中使用。

 

§ 当运行诱导的XF实时ATP速率测定时,寡霉素注射之后的OCR高于基础OCR,发生了什么?

     在寡霉素注射之前加入的化合物使电子传递与氧化磷酸化解偶联(如FCCP,DNP等等),通常会导致OCR增加。然而,这种呼吸不与ATP的产生偶联,因为没有ATP合酶的参与,线粒体膜电位会减少或消除,所以在这种环境下很少或没有ATP生成。在这些情况下,基础的mitoATP产生速率不能够被准确计算。如果怀疑存在解偶联化合物,那么推荐添加一组对照组,注射检测液+溶剂来计算基础的mitoATP产生速率。

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