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Seahorse XF 细胞线粒体压力测试实验
发布时间:2020-11-13   点击次数:62次

全面了解线粒体功能

1、实验背景

 安捷伦 SeahorseXF 细胞线粒体压力测试通过在 Seahorse XFe 和 XF 细胞外流量分析仪上直接测量细胞的氧消耗速率(OCR)来表征线粒体功能的关键参数。它是基于培养板的活细胞实验,能够实时监测 OCR。   

   实验使用 XF 传感器探针板内置的加药孔在实验过中将呼吸作用的调节剂加入细胞孔中,从而得到反映线粒体功能的关键参数。实验试剂盒里的调节剂为寡霉素(Oligomycin),羰基氰-4(三氟甲氧基)苯腙(Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy)Phenylhydrazone,FCCP),鱼藤酮(Rotenone)和kang霉素 A(Antimycin A)。

 

图1  安捷伦SeahorseXF细胞线粒体压力测试曲线,展示线粒体功能的关键参数

图 2  安捷伦 SeahorseXF 细胞线粒体压力测试 ETC 的调节剂,阐述电子传递链(ETC)复合物,并显示 Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒包含的所有调节剂的作用靶点。

寡霉素抑制 ATP 合酶(复合物 V),是实验中在基础测量之后一次注射的化合物。它影响或减少通过 ETC 的电子流,导致线粒体呼吸或 OCR  减少。减少的 OCR 与细胞 ATP 的产生相关。

羰基氰-4(三氟甲氧基)苯腙(FCCP是一个解偶联剂,它破坏质子梯度和线粒体膜电位。它是寡霉素后第二次注射的化合物。加入的结果是,通过ETC的电子流不受限制,复合物IV耗氧量达到最大。FCCP激发的OCR可用来计算备用呼吸能力,它的定义是最大呼吸和基础呼吸的差值。备用呼吸能力衡量细胞对增加的能量需求或压力的反应能力。

第三次注射的是复合物I的抑制剂鱼藤酮和复合物III的抑制剂kang霉素A的混合物。它们联合关闭了线粒体呼吸,从而能够计算由线粒体外的过程驱动的非线粒体呼吸。

1总结了这些化合物的作用效果。 

1线粒体呼吸调节剂作用靶点和效果总结

 

化合物

ETC靶点

对OCR的影响

寡霉素

ATP合酶(复合物V)

减少

FCCP

线粒体内膜

增加

鱼藤酮/kang霉素A

分别为复合物I和III

减少

 对线粒体功能进行评估使研究人员能够进一步了解代谢在细胞生理学,疾病病理学和病因学中的关键作用。

 SeahorseXF细胞线粒体压力测试是测量细胞线粒体功能的金标准,被广泛应用。本实验为了解线粒体功能障碍的原因和深入理解代谢途径,信号和表型提供了视角。

词汇表:

· 基础呼吸(Basal respiration):用来满足细胞ATP需求和线粒体质子渗漏的氧消耗。表示细胞在基础条件下的能量需求。

· ATP产生(ATP Production):加入ATP合酶抑制剂寡霉素后减少的氧气消耗速率,代表基础呼吸中被用来驱动ATP产生的部分。表示用来满足细胞能量需求的线粒体ATP产生。

· H+(质子)渗漏(H+ (Proton) leak):与 ATP产生不偶联的基础呼吸的剩余部分。质子渗漏可以被看作是线粒体损伤的标志,也可被看作是一种调节线粒体ATP产生的机制。

· 最大呼吸(Maximal respiration):加入解偶联剂FCCP之后获得的最大氧气消耗速率。FCCP通过刺激呼吸链以最大能力运转模拟生理的“能量需求”,导致底物(糖,脂肪和氨基酸)的快速氧化以应对这一代谢挑战。显示细胞能够达到的最大呼吸速率。

· 备用呼吸能力(Spare respiratory capacity):这个测量指标表示细胞应对能量需求的能力以及细胞呼吸与其理论最大值的差距。细胞应对能量需求的能力可作为细胞适应性或灵活性的一个指标。

· 非线粒体呼吸(Nonmitochondrial respiration):加入鱼藤酮和kang霉素A后,由于一部分细胞中的酶继续消耗氧而存留的氧消耗。这对于线粒体呼吸的准确测量很重要。

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