近年来，为尽可能的模仿细胞在生物体内的生长环境，得到更接近类似于体内生长的细胞, 越来越多研究人员开始关注三维细胞、类器官培养技术。

以下为大家介绍Biozellen 3D类器官培养基质胶的使用步骤：

A、试剂制备

A 基质胶：将 A 基质胶溶于 37℃水浴槽回温 10 分钟， 确认融解.

C 缓冲溶液(1X)制备：使用将 10X C 缓冲溶液用冰的无细胞培养液(例如： 无血清 DMEM、opt-MEM) 制备成 1X C 缓冲溶液。(不要用 PBS 稀释 C 缓冲液) .

D 缓冲溶液(1X)制备: 使用用冷的 1x PBS 稀释 10X D 缓冲溶液至 1X D 缓冲溶液.

B、Biozellen®3D 类器官培养基质胶的制备

全部步骤需要在无菌环境内操作，操作步骤如下：

1. 将 24 孔培养板放置于冰箱或者冰上预冷。

2. 细胞计数后取 2×105~2×107 细胞与 0.5ml 37℃ 培养基均匀混合，并与 0.5ml 37℃ A 胶按照 1:1 等比例均匀混合，终细胞密度 1*105~1*107cells/mL。

注：请选择适当的培养溶液与条件进行试验。

3.取 20-40 微升步骤 2 含细胞的混合 A 胶溶液滴于 步骤 1 预冷的培养板上，胶体将于 5 分钟内成胶。

注: 测试胶体是否成胶，可用微量吸管尖温和的触碰胶体表面进行确认。

4.待胶体成胶后，添加 1 毫升冰的 1X C 缓冲溶液，并盖过步骤 3 的胶溶液，固定 15 分钟。

5.待 15 分钟固定后，小心的吸取 C 缓冲溶液并置换为适合此细胞生长之培养基溶液。

6 将含有细胞的胶于 37°C 二氧化碳培养箱内进行 7~14 天的培养，并观察细胞球体的形成，按正常培养基更换频率进行更换操作。

C、溶胶与收集细胞球体准备程序

小心的将培养基吸取移除，并用 1X PBS 进行清洗。

小心的将 1X PBS 吸取移除，并添加 1 毫升冰的 D 缓冲溶液，盖过胶滴于室温反应 5 分钟。

温和的用 1 毫升移液管吸取，直到胶滴溶解。

将含有细胞球体的溶液吸入 1.5 毫升离心管，用 1000 rpm 的转速离心 10 分钟，移除上清液体并收集细胞球体做分析。

D、收集单颗细胞准备程序

在分离单细胞，先按上述溶胶与收集细胞球体准备程序进行操作

1. 添加 trypsin-EDTA 并与收集的细胞球体于 37°C 混合反应。

2. 用 1 毫升移液管混合，直到细胞体分解。

3. 待细胞球体分解，加入 3 倍体积的 1X PBS，并用 1000 转的转速进行离心 10 分钟，并移除上清液体收集沉淀的单细胞做分析。