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细胞自噬实验原理介绍
发布时间:2022-08-17   点击次数:63次

技术原理


自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物的过程,藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。

标记及追踪LC3以及自噬流的变化。其中GFP是酸敏感型GFP蛋白,而mRFP是稳定的荧光表达基团,不受外界影响。由于自噬小体进入第二阶段后,与溶酶体进行融合,形成自噬溶酶体。自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境,可以导致PH下降,GFP淬灭,因此,GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度,GFP越少,则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之,自噬小体和溶酶体融合被抑制,自噬溶酶体进程受阻。mRFP是一直稳定表达的,因而可以通过GFP与mRFP的亮点比例来评价自噬流进程。

实验方法

Step1:细胞培养

Step2:转染或药物处理

Step3:细胞收集

Step4:添加LC3-GFP-RPF病毒感染

Step5:荧光检测

结果展示

自噬流

自噬诱导剂

a)Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin :模拟内质网应激

b)Carbamazepine/ L-690,330/ Lithium Chloride(氯化锂):IMPase 抑制剂(即Inositol monophosphatase,肌醇单磷酸酶)

c)Earle's平衡盐溶液:制造饥饿

d)N-Acetyl-D-sphingosine(C2-ceramide):Class I PI3K Pathway抑制剂

e)Rapamycin:mTOR抑制剂

f)Xestospongin B/C:IP3R阻滞剂

自噬抑制剂

a)3-Methyladenine(3-MA):(Class III PI3K) hVps34 抑制剂

b)Bafilomycin A1:质子泵抑制剂

c)Hydroxychloroquine(羟氯喹)

自噬的评估通常采用多个自噬阶段的标志物,因为自噬小体数量的增加可能是自噬上调也可能是自噬阶段降解被抑制所致,所以设置合适的对照很有必要。

1. 透射电镜

2. WB检测标志物LC3/Atg8和p62/SQSTM1

3. WB检测Lamps、Atg5、Atg14和Beclin-1

4. 组织蛋白酶Cathepsin活力检测

5. IF检测自噬流auhagicflux返回搜狐,查看更多



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