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细胞凋亡检测实验原理
发布时间:2022-08-17   点击次数:52次

技术原理

细胞凋亡是细胞的基本特征,在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面都起到十分重要的作用。

在正常的活细胞中,磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)位于细胞膜的内侧,但在早期凋亡的细胞中,PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36 kDa的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力结合,可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。PI是一种核酸染料,它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜,但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红。因此,将Annexin V与PI联合使用时,PI 则被排除在活细胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)之外,而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC 和PI 结合染色呈现双阳性(Annexin V+/PI+)。

实验方法

Step1:细胞培养

Step2:转染或药物处理

Step3:细胞收集

Step4:加凋亡试剂

Step5:上机检测

案例展示

技术总结

1、考虑到进行流式时需要用到对照组细胞设置空白组(用于调节电压)和单染组细胞(用于调节补偿),因此要求该组细胞量较其他组多

2、如发现细胞密度偏低,细胞量较少,则适当增加离心时间。收集细胞时,应该连同上清一起收集,同时胰酶消化时间不宜过长,否则容易引起假阳性

3、检测细胞经过转染等处理后可能会带有自发荧光,应注意选择凋亡试剂盒的颜色通道 如:带绿色荧光时,应选择7AAD试剂盒

4、细胞铺板应选择细胞状态良好的时候进行,且避免反复吹打

5、流式检测细胞样本:细胞样品准备时,使用不含EDTA的胰酶消化细胞,不得使用细胞刮刀进行操作,胰酶消化细胞时切忌消化过头或没有打开细胞间隙


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