技术文章您的位置:网站首页 >技术文章 > 美国Azaood公司Fast One Step Cloning Kit REF AZ00008产品介绍
美国Azaood公司Fast One Step Cloning Kit REF AZ00008产品介绍
更新时间:2023-11-10   点击次数:321次

型号: AZ00008 

储运条件

-20℃

产品组成

产品简介

基于重组原理的无缝克隆技术,作为新一代的克隆方法,不依赖繁琐的酶切、连接步骤,也不需要末端补平等操作,依据DNA 片段与线性化载体末端的15~25 nt 同源序列的重组,可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点,载体自连背景低,是一种简单、快速的DNA 定向克隆技术。

Fast One Step Cloning Kit 无缝克隆试剂盒,一次反应可完成单至多个DNA 片段的重组,快仅需5 分钟即可完成单片段重组,且阳性率高于95%。Kit 中添加的辅助因子,有效提高克隆阳性率;经优化的反应体系,能够一定程度上耐受未纯化PCR 产物中含有的杂质。升版的无缝克隆试剂盒具有更高的阳性率、更好的兼容性。

实验步骤

1. 实验流程概要

2. 线性化克隆载体制备

选择合适的克隆位点,对载体进行线性化,载体的线性化可以通过酶切或反向PCR 扩增完成。

① 酶切制备

一些限制性内切酶不能有效地消化超螺旋DNA,因此可能会留下不同数量的未切割载体DNA,降低阳性率。推荐使用LightNingTM 快速内切酶进行酶切(单酶切或者双酶切),使载体线性化wanquan,以降低转化背景(未切割的载体转化获得的假阳性克隆)。

注1:经酶切进行线性化的载体无需去磷酸化,推荐使用双酶切。

注2:酶切完成后,建议将内切酶失活或对目的产物纯化后用于重组反应。

② 反向PCR 扩增制备

为减少扩增突变的引入,推荐使用高保真PCR Mix 进行扩增。推荐使用预线性化质粒作为模板,以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。

注1:PCR 产物无非特异性条带时, 推荐使用Template Eliminator( 货号:EG21203)消化质粒模板即可用于重组反应;反之建议将PCR 产物纯化后使用。

注2:多片段克隆时,建议将PCR 产物纯化后使用。

3. 插入片段PCR 引物设计

PCR 引物的5' 端必须包含与其相邻片段(插入片段或载体)末端同源的15~25 nt(推荐18 nt)序列。假如载体为粘性末端,且3' 端突出,则引物设计必须包含突出部分;若5' 端突出,则引物设计可以包含突出部分,也可以不包含。

插入片段正向扩增引物:

5'—上游载体末端同源序列+ 酶切位点(可选)+ 基因特异性正向扩增序列— 3'

插入片段反向扩增引物:

3'—基因特异性反向扩增序列+ 酶切位点(可选)+ 下游载体末端同源序列—5'

注1:尽量选择无重复序列且 GC 含量均匀的区域进行克隆,当载体克隆位点上下游25 nt 区域内 GC 含量为40%~60% 时,重组效率高;

注2:本试剂盒所提供的pUC 19 载体(Ampr)连接端序列如下:

4. 插入片段的PCR 扩增

推荐使用高保真PCR Mix 进行扩增,以减少扩增突变的引入。建议使用纯化后的PCR 产物进行无缝克隆反应,若PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物,可直接使用,但加样体积不应超过总反应体积的20%。

5. 重组反应

① 于冰水浴中配置以下反应体系:

a. 适载体用量(ng) = 0.02 × 载体碱基对数,即0.03 pmol。

b. 插入单片段,适片段用量(ng)= 0.04 × 片段碱基对数;插入多片段,每片段适用量(ng)= 0.02 × 片段碱基对数。

注1:若插入单片段的长度大于载体,则应互换载体与插入片段用量;

注2:若插入片段的长度小于200 bp,则插入片段应使用5 倍载体用量;

注3:若按上述公式计算得到的用量超过低/ 高值,则建议直接按低/ 高用量使用;

注4:载体片段过长、插入片段过长或片段数过多,克隆阳性率均会降低。

重组反应体系配制完成后,用移液枪轻轻吸打混匀各组分,避免产生气泡,切勿涡旋。

② 将反应体系置于50℃,反应5~60 min。

注1:推荐使用 PCR 仪等温控比较jingzhun的仪器进行反应,反应时间不足或太长克隆效率均会降低;

注2:插入1~2 个片段时,推荐反应时间为5~15 min;插入3~5 个片段时,推荐反应时间为15~30 min;

注3:当载体骨架在10 kb 以上或插入片段在4 kb 以上时,建议延长反应时间到30~60 min;

注4:50℃反应完成后,建议进行瞬时离心,将反应液收集至管底。

③ 将反应液离心管置于冰上冷却,之后进行转化或者储存于 -20℃。

注 1: -20℃储存的重组产物,建议在 1 周内使用。

6. 重组产物转化

取5~10 μl 反应液,加入到100 μl 感受态细胞中,缓慢吸打混匀,冰上放置30 min。42℃ 热激45~60 sec,冰浴5 min。加500 μl SOC或 LB 培养基,37℃ 振荡培养40~60 min(200 rpm)。将菌液均匀涂布在含有对应抗生素的平板上,倒置于37℃ 过夜培养。

注1:不同感受态细胞后的克隆阳性率会有所差别,推荐使用转化效率 > 108 CFU/μg的感受态细胞;

注2:菌落数取决于PCR 产物与线性化载体的数量和纯度;

注3:阳性对照平板通常生长大量白色单菌落,阴性对照平板只生长很少的菌落。

7. 阳性克隆检测

挑取单菌落至10 μl ddH2O 中混匀,95℃裂解10 min 后,取1 μl裂解液作为模板,进行菌落PCR 鉴定,或将单菌落接种至抗性培养基中培养过夜后,提取质粒进行酶切鉴定。

阳性对照的阳性克隆检测,菌落PCR 引物使用通用引物M13F 与M13R,酶切鉴定用HindIII 与EcoRI。

注1:菌落PCR 时建议至少使用一条通用引物,避免假阳性结果;

注2:必要时可进一步对阳性结果进行测序鉴定。

注3:M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R:CAGGAAACAGCTATGAC


©2024  上海创凌生物科技有限公司 All Rights Reserved.  网站地图  沪ICP备2023009255号-1  管理登陆  技术支持:化工仪器网
在线客服 二维码

扫一扫,关注我们