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qRT-PCR检测细胞中BCL基因表达实验报告书范本
发布时间:2019-12-09   点击次数:1287次

一、 实验仪器与试剂

 表格一:实验仪器

仪器名称

型号

生产厂家

低温高速离心机

64R

BECKMAN  

PCR 仪

9700

ABI

荧光定量 PCR 仪

7500

ABI

 

仪器

厂家

型号

小型垂直电泳槽

Biorad

164-8001

转印槽

Biorad

Trans-Blot

脱色摇床

常州澳华

TY-80B

电泳仪

上海天能

EPS-200

低温高速离心机

64R

BECKMAN

酶标仪  

Thermo

Thermo Scientific Microplate Reader

 表格二:试剂

试剂名称

厂家

PBS (0.01M, pH 7.4)

自配

Trizol

Life Technologies

Lv仿

国药集团

异丙醇

国药集团

乙醇

国药集团

PrimeScript® RT reagent Kit

Takara

荧光定量试剂盒

Takara

 

二、 实验步骤

1、样本处理

4℃ 12000rpm 离心收集细胞,弃上清。PBS 清洗 1 遍后,加入 1mL Trizol 充分混匀。

2、两相分离 每个样品中加入 0.2 mL 的lv仿,盖紧管盖,剧烈振荡管体,室温静置 5min。4℃下 12000rpm

离心 15 min。离心后混合液体将分为下层的红色酚lv仿相,中间层和上层的无色的水相。RNA 全部被分配于水相中。水相的体积大约是匀浆时加入的 Trizol 试剂的 60%。

3、RNA 沉淀 将水相转移到新离心管中。加入等体积的异丙醇,水相与异丙醇混合以沉淀其中的 RNA。混匀并在室温孵育 10 min 后,4℃ 12000rpm 离心 10 min。

4、RNA 清洗 移去上清液,加入 1 mL 75%乙醇,清洗 RNA 沉淀。振荡后,4℃ 7500 rpm 离心5 min。

5、重新溶解 RNA 沉淀

去除乙醇溶液,空气中干燥 RNA 沉淀 5-10 min。溶解 RNA 时,先加入无 RNA 酶的水用枪反

复吹打几次,然后 55 到 60℃孵育 10 min。获得的 RNA 溶液保存于- 70℃。

6、反转录

1) 按下列组份配制 RT 反应液

5×PrimeScript Buffer

5 μL

PrimeScript® RT Enzyme Mix I

1 μL

Oligo dT Primer(50 μM)×1

1 μL

Random 6 mers(100 μM)×1

1.5 μL

Total RNA

1 ng

RNase Free ddH2O

Up to 25 μL

2)反转录反应条件如下: 37℃ 15min,85℃ 5s。

3)反应结束后,将其放在冰上待用或-20℃保存。

7、荧光定量 PCR

引物设计

Gene

Forward Primer

Reverse Primer

β-action

5′-TTCCAGCCCTCCTTCCTG-3′

5′-GCCCGACTCGTCATACTCC-3′

BCL

5′ -CTACCGTCGTGACTTCGC -3

3′-CCTATTGCCTCCGACCCT-5′

 

 

按下列组份配制 Realtime PCR 反应体系

 

SYBR Premix Ex Taq

10 μL

PCR Forward Primer(10μM)

1 μL

PCR Reverse Primer(10μM)

1 μL

cDNA 模板

1 μL

ddH2O

7 μL

Total

Up to 20 μL

 

用漩涡振荡器将管中溶液彻底混合均匀,短暂低速离心。

3)点样。将混合好的液体加入孔板中,每个样本的每个基因保证3个复孔,点完样之后将 PCR 板置于离心机中 2000rpm、2min,然后用锡箔纸将板包好,置于 4 度冰箱中备用。 4) PCR 反应

Real time PCR 仪使用 ABI7500,PCR 程序已优化 将步骤 3 中已点好样的 PCR 板置于 Realtime PCR 仪上进行 PCR 反应:首先是预变形:95℃/10min

第二步是循环反应 40 cycles : 95℃/15s; 60℃/45s(收集荧光) ;72℃/45s 第三步溶解曲线:95℃/15s; 60℃/1min ;95℃/15s

 

三、 结果与计算(采用 2 - △△ CT 法进行分析)

基因相对表达量

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