一、 实验仪器与试剂

表格一：实验仪器

表格二：试剂

二、 实验步骤

1、组织中蛋白上清液的制备和浓度测定

把组织剪切成细小的碎片；

加入 200μL 裂解液，在匀浆机中研磨，直至裂解液中组织消失；

充分裂解后，12000rpm 离心 5min，取上清。

取部分上清蛋白用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，按如下步骤：  ①按试剂盒说明书将 A 液和 B 液以 50：1 的比例配制成工作液；

②取 2000μg/mL 的 BSA 标准品，用 PBS(pH 7.4)稀释成 2000μg/mL、1500μg /mL、1000μg/mL、

750μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、25μg/mL、0μg/mL 共 9 个浓度梯度；

③取上清液 10μL，用 PBS 稀释 20 倍；

④每管中加 20μL 蛋白标准品或稀释后的上清液，再加上述工作液 0.2mL，37℃孵育 30min，

562nm 处测吸光度，记录 OD 值；

⑤根据蛋白标准品的浓度及相应 OD 值绘制标准曲线：

根据标准方程计算样品总蛋白浓度（mg/mL）

2、Western-Blot 检测总蛋白中目的蛋白表达。

灌胶

①蒸馏水清洗灌胶玻璃板，竖直晾干。

②配制 13％分离胶 10mL，加 TEMED10μL、10％过硫酸铵 100μL，混匀后立即灌胶，灌至齿梳下缘 2～3mm（事先做好标记），用异丙醇封闭液面以去除气泡并隔绝空气，室温静置 45min 待胶*聚合。

③待分离胶*聚合后，倾去其顶部的去离子水，用滤纸将水吸干。

④配制 4％浓缩胶 5 mL，加 TEMED 5 μL、10％APS 50 μL，混匀立即灌胶，灌至顶部，并垂直插入 Teflon 齿梳，室温静置 20 min 待胶聚合。

⑤待胶*聚合后拔出梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，用电泳缓冲液冲洗上样孔以去除气泡。

电泳

①取各个处理组蛋白提取液，调整蛋白浓度为 6μg/μL，和等体积 2×上样缓冲液混合，即为上样液。

②将上样液于 100℃沸水中煮沸 5min，使蛋白变性，冰上骤冷，3000 转/min 离心 1min。

③每孔加上样液 15μL，留一孔加 10μL 预染的 Marker。加满电泳缓冲液，盖上槽盖，接通电源，先用 80v 恒压电泳，约 20min，当指示剂溴酚蓝进入分离胶后改用 110v 恒压电泳，当指示剂到达距凝胶下端约 0.5cm 处时关闭电源，取出胶板。

转印蛋白及免疫检测

①在电泳即将结束前，预先将 PVDF 膜浸泡在甲醇中 15s，然后用 ddH2O 漂洗 2min，浸泡于转移缓冲液中 5min 后开始后续操作。

②在水中撬胶，修胶后将胶浸泡于转移缓冲液中平衡 15min。

③按黑面（负极）→海绵→滤纸→胶→PVDF 膜→滤纸→海绵→红面（正极）的顺序制备转膜“三明治”，每层铺好后先赶走气泡再铺另一层。在转移缓冲液中制备三明治可避免气泡的产生。

④接上正负极，按膜向正极的方向将转移盒放入电转仪中，加入转膜缓冲液。

⑤将电转仪置于冰水中，100V 恒压转膜 1h。

⑥转膜结束后，快速取出 PVDF 膜，放入 5%BSA 室温封闭 2h。

⑦取出膜，于摇床上用 TBST 洗膜 5min×3 次。

⑧孵育袋中加入 TBST 稀释的一抗（1：500）4℃孵育过夜。

⑨TBST 洗膜 5min×3 次，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠二抗（1：3000），室温孵育 1h。

⑩TBST 洗膜 10min×3 次。膜于化学发光检测试剂反应至暗处出现亮条带，取出膜，甩去多余的液体，用保鲜膜包好 PVDF 膜，暗室中用 X 胶片感光、显影、定影。