技术文章您的位置:网站首页 >技术文章 > Western blotting检测组织中蛋白表达实验报告书
Western blotting检测组织中蛋白表达实验报告书
发布时间:2019-12-09   点击次数:878次

一、 实验仪器与试剂

表格一:实验仪器

仪器

厂家

型号

小型垂直电泳槽

Biorad

164-8001

转印槽

Biorad

Trans-Blot

脱色摇床

常州澳华

TY-80B

电泳仪

上海天能

EPS-200

低温高速离心机

64R

BECKMAN

酶标仪  

Thermo Scientific

Multiskan Spectrum

 

表格二:试剂

试剂

厂家

RIPA 裂解液

碧云天

PMSF

Amresco

BCA 蛋白定量试剂盒

Thermo

Tris

Amresco

甘氨酸

Amresco

盐酸

国药集团

甲醇

国药集团

Tween 20

国药集团

SDS

国药集团

TEMED

Sigma

BSA

Sigma

PVDF 膜

Millipore

HRP 标记的羊抗小鼠二抗

联科生物

化学发光检测试剂

Thermo

GAPDH 鼠单克隆抗体

联科生物

预染蛋白 marker

碧云天

X 光胶片

柯达

 

二、 实验步骤

1、组织中蛋白上清液的制备和浓度测定

把组织剪切成细小的碎片;

加入 200μL 裂解液,在匀浆机中研磨,直至裂解液中组织消失;

充分裂解后,12000rpm 离心 5min,取上清。

取部分上清蛋白用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度,按如下步骤:  按试剂盒说明书将 A 液和 B 液以 50:1 的比例配制成工作液;

取 2000μg/mL 的 BSA 标准品,用 PBS(pH 7.4)稀释成 2000μg/mL、1500μg /mL、1000μg/mL、

750μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、25μg/mL、0μg/mL 共 9 个浓度梯度;

取上清液 10μL,用 PBS 稀释 20 倍;

每管中加 20μL 蛋白标准品或稀释后的上清液,再加上述工作液 0.2mL,37℃孵育 30min,

562nm 处测吸光度,记录 OD 值;

根据蛋白标准品的浓度及相应 OD 值绘制标准曲线:

根据标准方程计算样品总蛋白浓度(mg/mL)

样品

1

2

3

4

5

6

7

8

9

OD 值

0.817611

0.438412

0.657716

0.675617

0.362568

0.817774

0.688089

0.477546

0.627511

0.991314

0.517018

0.814846

0.748083

0.460470

0.622999

0.574448

0.404516

0.700393

均值

0.904462

0.477715

0.736281

0.711850

0.411519

0.720386

0.631268

0.441031

0.663952

浓度  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

mg/mL

21.46

9.27

16.66

15.96

7.38

16.21

13.66

8.22

14.59

 

2、Western-Blot 检测总蛋白中目的蛋白表达。

灌胶

蒸馏水清洗灌胶玻璃板,竖直晾干。

配制 13%分离胶 10mL,加 TEMED10μL、10%过硫酸铵 100μL,混匀后立即灌胶,灌至齿梳下缘 2~3mm(事先做好标记),用异丙醇封闭液面以去除气泡并隔绝空气,室温静置 45min 待胶完全聚合。

待分离胶完全聚合后,倾去其顶部的去离子水,用滤纸将水吸干。

配制 4%浓缩胶 5 mL,加 TEMED 5 μL、10%APS 50 μL,混匀立即灌胶,灌至顶部,并垂直插入 Teflon 齿梳,室温静置 20 min 待胶聚合。

待胶完全聚合后拔出梳子,将凝胶置于电泳槽中,加入电泳缓冲液,用电泳缓冲液冲洗上样孔以去除气泡。

电泳

取各个处理组蛋白提取液,调整蛋白浓度为 6μg/μL,和等体积 2×上样缓冲液混合,即为上样液。

将上样液于 100℃沸水中煮沸 5min,使蛋白变性,冰上骤冷,3000 转/min 离心 1min。

每孔加上样液 15μL,留一孔加 10μL 预染的 Marker。加满电泳缓冲液,盖上槽盖,接通电源,先用 80v 恒压电泳,约 20min,当指示剂溴酚蓝进入分离胶后改用 110v 恒压电泳,当指示剂到达距凝胶下端约 0.5cm 处时关闭电源,取出胶板。

转印蛋白及免疫检测

在电泳即将结束前,预先将 PVDF 膜浸泡在甲醇中 15s,然后用 ddH2O 漂洗 2min,浸泡于转移缓冲液中 5min 后开始后续操作。

在水中撬胶,修胶后将胶浸泡于转移缓冲液中平衡 15min。

按黑面(负极)→海绵→滤纸→胶→PVDF 膜→滤纸→海绵→红面(正极)的顺序制备转膜“三明治”,每层铺好后先赶走气泡再铺另一层。在转移缓冲液中制备三明治可避免气泡的产生。

接上正负极,按膜向正极的方向将转移盒放入电转仪中,加入转膜缓冲液。

将电转仪置于冰水中,100V 恒压转膜 1h。

转膜结束后,快速取出 PVDF 膜,放入 5%BSA 室温封闭 2h。

取出膜,于摇床上用 TBST 洗膜 5min×3 次。

孵育袋中加入 TBST 稀释的一抗(1:500)4℃孵育过夜。

TBST 洗膜 5min×3 次,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠二抗(1:3000),室温孵育 1h。

TBST 洗膜 10min×3 次。膜于化学发光检测试剂反应至暗处出现亮条带,取出膜,甩去多余的液体,用保鲜膜包好 PVDF 膜,暗室中用 X 胶片感光、显影、定影。

©2020  上海创凌生物科技有限公司 All Rights Reserved.  网站地图    管理登陆  技术支持:化工仪器网
在线客服 二维码

扫一扫,关注我们