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流式细胞仪检测A172细胞周期的实验报告
发布时间:2019-12-09   点击次数:340次

一、 实验仪器与试剂

表格一:实验仪器

仪器

厂家

型号

细胞培养箱

Thermo Scientific

HERA cell CO2

低温高速离心机

64R

BECKMAN  

流式细胞仪

BD

FACS Calibur

 

表格二:试剂

试剂

厂家

DMEM 培养液

Hyclone

PI

Sigma

PBS 7.4 (0.1 M)

自配

乙醇

国药集团

RNA 酶

Sigma

二、 实验步骤

细胞培养 取对数生长期的 A172 细胞,按 1*105个/mL 以 1mL 体积接种于 6 孔板内。无抗生素培养液培养过夜,到转染时使细胞达到 70%的汇合率。

转染

将 12.5uL siRNA 溶于 387.5uL 无血清的 DMEM 中,混合均匀。

将 12.5uL Lipofectamine 2000 溶于 387.5uL 无血清的 DMEM 中,混合均

匀。在室温下孵育 5 分钟。

将上述两种混合物混合(总体积 800uL),轻轻混合均匀在室温下孵育

20 分钟形成复合物。

在 6 孔板中每孔加入 800uL 复合物。十字法混合均匀。

细胞在 37℃、5%CO2培养箱中培养 6h 后弃上清液,并加入 10%胎牛血

清的 DMEM 培养液。

固定

培养 48h 后小心吸去上清,胰酶消化并离心收集细胞(1000rpm/min),弃上清,用预冷 PBS 洗细胞 2 次,加入预冷 70%乙醇, -20℃固定保存。

染色

离心,弃上清;

1mL PBS 洗 1 次,离心;

加入 10uL RNase A(20ug/mL)于 500uL PBS, 37 度 30min 孵育后,离心;

PBS 洗 1 次,离心;

加 10uL PI (50 ug/mL)于 500 uL PBS,室温避光 30min。  

检测

以标准程序用流式细胞仪检测,汞激发波长 488nm,计数 1 万个细胞,结果

使用 Modfit 软件分析。

三、 实验结果

省略

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